澳洲坚果MtMADS1-like基因的克隆与表达分析

MADS～box家族基因广泛分布于植物中,在植物花发育的整个阶段起着至关重要的作用.为了探索MADS-box基因在澳洲坚果花发育过程中的分子机理,本研究以澳洲坚果'695'为试材,采用RT-PCR及RACE技术克隆获得澳洲坚果MADS-box类转录因子基因cDNA全长,命名MtMADS1-like(GenBank登录号:MK491608).该基因全长967 bp,开放阅读框ORF长672 bp,编码223个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR分别为58 bp和237 bp.序列分析表明,MtMADS1-like具有保守的MADS-box结构域(MADS-MEF2-like)和半保守的K-box结构域,属于Type Ⅱ型MADS-box家族基因.进化分析表明,MtMADS1-like与其他植物中MADS-box蛋白具有较高的同源性,且与猴面花(Erythranthe guttata)MADS-box家族中SVP254的同源性高达67.10％,亲缘关系最近.生物信息学分析表明MtMADS1-like属于不稳定的亲水性蛋白,不具备信号肽,属于非分泌蛋白,α-螺旋和无规则卷曲构成了二级结构的主要蛋白框架,三级结构中MADS-box结构域和K-box形成该蛋白的核心结构,并且作为转录因子定位于细胞核.qPCR分析表明,MtMADS1-like基因在不同的澳洲坚果品种中差异表达,在品种'333'中表达量最高,在品种'344'中表达量最低.研究结果为进一步验证MtMADS1-like的功能及阐明澳洲坚果花发育和开花调控的分子机制奠定了基础.     

澳洲坚果MibZIP1基因克隆及表达规律分析

为研究澳洲坚果（Macadamia integrifolia）中bZIP转录因子家族成员在逆境抗性中潜在功能,从‘桂热1号’品种果实中克隆MibZIP1基因。结合转录因子结构分析和不同处理下表达规律进行分析发现MibZIP1基因序列长度1 157 bp,基因编码区长度927 bp,编码308个氨基酸。MibZIP1存在典型bZIP superfamily结构域。系统进化分析鉴定出澳洲坚果MibZIP1、蒂罗花（Telopea speciosissima）TsbZIP60和荷花（Nelumbo nucifera）NnbZIP60亲缘关系较近。组织表达分析结果表明MibZIP1在‘桂热1号’品种叶片中的表达量最低,在‘695’品种枝条中的表达量最高。其在受玉米素、水杨酸、乙烯利和脱落酸处理的“桂热1号”叶片中显著上调表达,在赤霉素和过氧化氢处理的“桂热1号”叶片中表达差异不显著。推测MibZIP1与澳洲坚果抗逆性有关,为研发澳洲坚果新型栽培和激素调控技术提供理论指导。     

萼脊兰AP1-like基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从萼脊兰(Sedirea japonica)花瓣中分离到1个MADS-box A类基因,该基因命名为AP1-like(登录号JQ776636)。AP1-like基因的cDNA全长1 221bp,包含1个753bp的开放阅读框(ORF),共编码250个氨基酸。蛋白序列比对和进化树分析表明,AP1-like蛋白与蝴蝶兰ORAP11蛋白的一致性为96%,进化距离最近。二级结构分析表明,该蛋白分子属于亲水性蛋白,其中有53.60%的α螺旋、7.20%的延伸链、39.20%的不规则折叠。实时荧光定量PCR分析表明,萼脊兰AP1-like基因在盛花期的根和叶中表达量最高;在生殖器官中花蕾期花葶的表达量最高,其次是花蕾;盛花期中花葶的表达量最高,子房和合蕊柱的表达量次之,萼片、花瓣、唇瓣均有微量表达。研究认为,AP1-like可能在调控植物由营养生长向生殖生长过渡阶段及子房的建成中起重要作用。     

澳洲坚果MiMYB2基因克隆及结构与功能分析

为研究R2R3-MYB转录因子家族成员在澳洲坚果生长发育和产量形成中的作用机制,利用PCR技术从澳洲坚果品种“桂热一号”叶片中克隆MiMYB2基因并采用生物信息学对其结构及功能进行分析。结果表明,克隆获得的MiMYB2（NCBI登录号：MN254976）基因cDNA序列全长1 210 bp,开放阅读框（ORF）1 002 bp,编码333个氨基酸。MiMYB2编码一个无跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水蛋白,含两个SANT保守结构域,属于R2R3-MYB家族。BLAST分析发现MiMYB2与荷花NnMYB3-like氨基酸序列同源性最高。系统进化分析将MiMYB2与AtMYB17、AtMYB106和AtMYB16聚类为S9亚族。通过转录组数据分析MiMYB2基因在“桂热一号”和“695”品种澳洲坚果枝条、花和叶片中的表达模式,表明MiMYB2在“桂热一号”品种花中的表达量最低,“695”品种花中的表达量最高。推测MiMYB2与澳洲坚果花生长发育密切相关。本研究为阐明MiMYB2基因在澳洲坚果生长发育和产量形成中的作用机制提供理论参考。     

棉花MADS-box蛋白基因(GhMADS-13)的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作,以中棉所36(CCRI)均一化全长cDNA文库为基础,结合EST测序分析,分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA.该基因cDNA全长1 079 bp,包含一个732 bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域和完整的K区,命名为GhMADS-13(GenBank:FJ409870).与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性.实时定量RT-PCR分析表明,GhMADS-13在CCR136的花器官发育中早期表达量逐步增加,后期有下降趋势.推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用.     

夏枯草PvDXS基因的克隆和表达分析

该研究在夏枯草转录组测序的基础上设计特异引物,采用逆转录PCR技术获得该基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR法分析PvDXS在夏枯草不同组织及不同外源性物质诱导下的表达量。结果表明:克隆得到的PvDXS基因开放阅读框2 181 bp,编码726个氨基酸,理论分子量为78 040.47 D,等电点为6.75,PvDXS蛋白具有Transketolase_C结构域和Transket_pyr结构域,系统进化树结果表明,PvDXS蛋白与丹参、长春花的DXS(SmDXS2、CrDXS2)亲缘关系较近,推测PvDXS属于第Ⅱ类DXS蛋白。qRT-PCR分析表明,PvDXS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA₃处理组该基因表达量升高,其他6种外源性物质处理后表达量均降低,其中CaCl₂、SNP、SA处理后该基因的表达量显著降低。PvDXS基因在不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。这为进一步研究PvDXS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

欧李DAM5基因的克隆及表达分析

休眠相关MADS-box(DAM)基因在植物芽休眠诱导过程中发挥重要作用。该研究以欧李‘农大4号’不同阶段的芽为材料,利用PCR技术,克隆获得ChDAM基因。ChDAM基因全长705 bp,编码234个氨基酸。多序列比对与结构域分析发现,ChDAM基因编码的蛋白具有典型的MADS-box结构域和K-box结构域,其氨基酸序列与桃的DAM5蛋白相似性较高。启动子分析发现,ChDAM5基因的表达可能会受到低温和脱落酸的调控。实时荧光定量PCR分析发现,ChDAM5基因的表达随着休眠诱导进程逐渐升高。研究推测,ChDAM基因在诱导欧李芽休眠中发挥关键作用,为后续深入的代谢途径研究奠定了基础。     

喉癌相关基因LCRG1的克隆和表达分析

喉癌是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤。选用在mRNA差异显示研究中获得的在喉癌组织中表达显著下调且代表新基因的EST之一（AF10056）,设计引物进行cDNA文库筛选,得到一全长为3448bp的cDNA序列,其开放读码框编码288个氨基酸,与已知蛋白质无明显同源性,属一新发现的基因,GenBank接受号为AF268387。与GenBank数据库匹配分析,发现该基因包含6个外子,基因组RT－PCR显示有40％（12／30）的喉癌组织表达下调,RT－PCR显示有54．5％（6／11）其他肿瘤细胞系表达缺失。把该基因命名为喉癌相关基因（laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1)。这提示LCRG1可能与喉癌的发生发展相关。     

大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因的克隆与表达分析

【目的】储存蛋白是昆虫发育、变态和生殖过程中氨基酸的主要来源,Hexamerin是储存蛋白家族重要成员,在昆虫的生长发育中起着重要作用。为了研究hexamerin基因(SpbHex)在大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumurav生长发育过程中的作用,对大豆食心虫SpbHex基因进行克隆与表达分析。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆SpbHex的cDNA全长序列,并通过qPCR研究其在不同发育阶段和幼虫不同组织的表达情况。【结果】SpbHex基因cDNA序列全长2 161 bp,其中开放阅读框2 112 bp,编码703个氨基酸。蛋白预测分子量84.15 ku。hexamerin基因在大豆食心虫不同发育阶段和不同组织中均有表达。在不同生长发育阶段中4龄幼虫的表达量较高,1龄和成虫的表达量较低;在不同组织中脂肪体的表达量较高,表皮中的表达量最低。【结论】本研究克隆了大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因,并对其在大豆食心虫中表达模式进行分析,为进一步明确hexamerin基因在大豆食心虫生长发育中的作用奠定基础。     

枸杞LbSPL6基因的克隆及表达分析

从实验室前期对枸杞(Lycium barbarum L.)花发育过程转录组测序结果推测,枸杞Squamosa启动子结合蛋白(Squamosa promoter binding protein-like, SPL)转录因子可能在枸杞花发育过程中发挥重要功能。该研究以宁夏特色植物资源枸杞为材料,采用RACE方法克隆LbSPL6基因,通过生物信息学及基因表达分析对该基因进行初步研究。结果表明:(1)成功克隆获得LbSPL6基因,其开放阅读框全长1 524 bp,编码507个氨基酸,分子量为55.34 kD;序列分析表明LbSPL6蛋白中包含3个保守基序,且氨基酸序列与茄科植物同源蛋白的氨基酸序列高度相似。(2)qRT-PCR分析证实,LbSPL6基因在枸杞花器官中表达,并且在花药发育的四分体时期及单核花粉时期表达量较高;亚细胞定位实验证明,LbSPL6蛋白定位于细胞核中。该研究结果为进一步研究枸杞LbSPL6转录因子在花发育过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

长白落叶松过氧化氢酶LoCAT1基因克隆及表达分析

为了解长白落叶松过氧化氢酶(CAT)基因的相关信息,探究该基因在长白落叶松不同组织中及不同逆境胁迫下的表达特性,本研究根据长白落叶松转录组数据库中获得的CAT1基因全长序列设计引物,克隆得到长白落叶松CAT1基因,命名为LoCAT1。该基因完整的开放阅读框(ORF)长度为954bp,共编码317个氨基酸。系统进化树分析结果显示,LoCAT1基因与北美云杉、银杏等CAT基因亲缘关系较近。利用实时定量RT-PCR技术分析了LoCAT1基因在长白落叶松中的组织表达特异性和应对非生物胁迫的表达模式。结果表明:LoCAT1基因在长白落叶松的根、茎、叶中均有表达,其中在茎部表达量最低,在叶中相对表达量最高。在非生物胁迫下,LoCAT1基因在长白落叶松根、茎、叶中的表达均发生了变化,但表达模式不同。在NaCl处理后,根和茎中LoCAT1基因均表现为下调表达,在12h时表达量最低,而叶中LoCAT1基因表达在24h明显受抑制,随后被上调表达,胁迫96h时表达量最高。PEG6000处理后,根和茎中LoCAT1基因的表达在胁迫早期被明显抑制,随后被上调表达。而叶中LoCAT1基因的表达在所有时间点均表现为上调表达。本研究推测长白落叶松LoCAT1基因可能参与了植物响应逆境胁迫的应答。     

枣树肌动蛋白基因cDNA片段的克隆及其表达分析

根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计引物,以壶瓶枣(Ziziphus jujuba Mill.Hupingzao)刚萌发结果枝构建的cDNA文库为模板,利用PCR技术得到了一个478 bp的cDNA片段.与其它植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在70%以上,氨基酸序列的同源性在85%以上,证明它是肌动蛋白基因在枣树中的同源cDNA片段,命名为ZjAT1(Ziziphus jujuba actin1),GenBank登录号为EU251882.DNA印迹分析结果表明,ZjAT1在枣树基因组中以单拷贝的形式存在.对不同发育阶段的不同器官组织进行了RT-PCR分析,结果显示ZjAT1基因只在花和幼果中有明显表达,在毛根、幼茎、叶片、成熟茎尖、成熟茎段以及成熟果实的果肉和种仁中都没有检测到表达.     

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌OXA-23-like基因的克隆和表达

扩增耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii) OXA-23-like基因,并表达纯化该蛋白,为深入研究鲍曼不动杆菌亚单位蛋白疫苗提供理论基础。从60份样品中分离并扩增出OXA-23-like基因,构建于p GEX-6p-1表达载体中,用BL21表达宿主细胞诱导表达并纯化蛋白;免疫印迹试验(Western blotting)验证OXA-23-like蛋白保守性。结果显示,成功构建pGEX-6p-1-OXA-23-like质粒,表达并纯化蛋白;Western blotting实验表明临床菌株OXA-23-like蛋白表达阳性。OXA-23-like基因和蛋白表达保守性高,具有免疫原性,是鲍曼不动杆菌疫苗良好的抗原靶点。     

甘蔗MOC1基因(ScMOC1)的克隆与表达分析

MONOCULM 1(MOC1)基因在植物腋分生组织和腋芽的形成中发挥重要作用,是植物分蘖关键调控基因。本研究利用同源基因克隆法结合RT-PCR、RACE技术从甘蔗品种ROC22中克隆获得MOC1的同源基因,命名为Sc MOC1。生物信息学分析发现该基因的c DNA序列包含一个长度为1299 bp的开放阅读框,编码432个氨基酸残基组成的含有GRAS保守结构域的非分泌蛋白,其分子量为45.43 k D,理化等电点p I为6.98。序列比对分析显示Sc MOC1与高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)、赖草(Leymus secalinus(Georgi)Tzvel.)、水稻(Oryza sativa L.)等禾本科植物同源蛋白氨基酸序列一致性较高;系统进化树分析显示其与高粱、小米草(Setaria italica(L.)P.Beauv.)、玉米(Zea mays L.)等禾本科植物MOC1同源蛋白亲缘关系最近;Sc MOC1在甘蔗品种ROC22中的序列变异分析发现,30个克隆得到的序列中共有46个SNP位点和29处In Del位点,其中1个位点发生的单个碱基缺失和另一个位点的4个碱基插入是造成基因编码蛋白序列变化的主要原因。中性检测表明,Sc MOC1在ROC22中遵循中性进化模型。采用实时荧光定量PCR分析Sc MOC1在甘蔗品种ROC22分蘖期不同组织部位(根、茎、叶、分蘖芽、叶鞘、生长点)、茎尖生长点和不同发育阶段腋芽(幼嫩腋芽、半大腋芽、较大腋芽、成熟休眠腋芽)的表达特征,结果显示Sc MOC1在分蘖期的ROC22中的表达具有组织特异性,在生命活跃的茎尖生长点处表达量最高;在腋芽形成发育过程中该基因表达总体呈现出"升-降-升-降"的趋势,说明Sc MOC1基因可能在甘蔗腋芽形成发育阶段中发挥作用。以上研究可推测Sc MOC1在甘蔗的分蘖性状调控上扮演重要的角色。本研究为Sc MOC1的功能研究及其在甘蔗产量分子辅助育种中的利用奠定基础。     

海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析

根据EST(expressed sequence tags,EST)序列信息,从海南普通野生稻中克隆了一个AP2/ERF(apetala2/ethylene response factor)类转录因子OrERF1。该基因包含一个1 014 bp的完整阅读框,编码337个氨基酸。推导OrERF1氨基酸序列具有典型的AP2/ERF类转录因子结构特征,与水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)和橙子(Citrus sinensis)中相应的AP2/ERF类蛋白具有较高的同源性。聚类分析表明OrERF1是ERF类转录因子。对OrERF1启动子序列进行分析,发现存在多种激素应答和胁迫响应的调控元件。Real-time PCR结果显示,低温、干旱和盐胁迫均能诱导OrERF1的表达。这些结果表明OrERF1可能在逆境响应过程中具有重要功能。     

草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析

植物MADS-box基因家族编码高度保守的转录因子,参与了包括花发育在内的多种发育进程。为阐释双子叶植物草原龙胆（Eustoma grandiflorum）花器官发育的分子调控机制,根据MADS-box基因保守序列设计简并引物,用3＇-RACE方法从草原龙胆中克隆了4个花器官特异表达的MADS-box家族基因。序列和系统进化树分析表明,这4个基因分别与金鱼草DEF基因、矮牵牛FBP3基因和FBP6基因以及拟南芥SEP3基因具有很高的同源性,分别属DEF/GLO、AG-like和SEP-like亚家族。从而将这4个基因分别命名为EgDEF1、EgGLO1、EgPLE1和EgSEP3-1。推导的氨基酸序列显示,这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域,每个基因均有其亚家族特异的C-末端功能域。基因特异性RT-PCR检测结果显示：EgDEF1在萼片、花瓣、雄蕊及胚珠中高丰度表达,在心皮中微量表达;而EgGLO1在花瓣和雄蕊中高丰度表达,在萼片中微量表达;在根、茎、叶等营养器官中均未检测到上述2个基因的表达。EgPLE1在雌蕊、心皮和胚珠中特异表达,但表达的丰度存在差异,在雄蕊中的表达有所减弱。SEP-like亚家族基因EgSEP3-1在四轮花器官和胚珠中均特异表达,且表达丰度相对一致。