尼古丁通过PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬诱导BEAS-2B细胞凋亡

吸烟是慢性呼吸系统炎症疾病最主要危险因素.尼古丁是烟草烟雾中最主要成分,与尼古丁相关的慢性呼吸系统疾病的发病率与日俱增.因此,寻找与尼古丁相关的慢性呼吸系统炎症疾病的潜在靶点是急需解决的问题.本研究旨在探究尼古丁对BEAS-2B细胞凋亡的影响及其潜在作用机制.采用蛋白质印迹法检测各组中的细胞内凋亡、自噬和PI3K/Ak...     

沉默信息调节因子2同源蛋白1通过Akt/PKB通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡

沉默信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1/sirtuin 1)是组蛋白去乙酰化酶,参与表观遗传修饰调节,促进多种细胞的生存,但目前对椎间盘髓核细胞的作用未见研究．为了阐明临床不同来源的椎间盘髓核手术标本SIRT1的表达变化,用免疫组化、定量RT-PCR、Western blot方法对中老年腰椎间盘突出症病人及青壮年腰椎骨折病人术中髓核标本进行研究,表明老年人髓核SIRT1的mRNA及蛋白质水平均显著低于青壮年的髓核．同时,用resveratrol(SIRT1激动剂)、烟碱(SIRT1抑制剂)、SIRT1-siRNA对培养的退变髓核细胞进行处理或转染后,用流式细胞仪检测凋亡率变化,结果表明resveratrol能显著促进退变髓核细胞生存,相反,当烟碱或SIRT1-siRNA转染后则显著促进髓核细胞凋亡．为了进一步分析SIRT1抑制退变髓核细胞凋亡的分子机制,应用Western blot及抑制剂方法研究表明,当SIRT1-siRNA转染髓核细胞后能降低磷酸化Akt蛋白的表达,而白藜芦醇处理则促进磷酸化Akt蛋白的表达,当用LY294002(PI3K抑制剂)或Akt-siRNA转染后显著抑制髓核细胞的生存率．研究结果表明,SIRT1通过Akt通路能显著抑制髓核细胞凋亡,为深入揭示退变性椎间盘疾病的病理生理及生物治疗提供新的思路和靶点．     

缺氧诱导因子1与PI3K/Akt/mTOR信号转导通路

缺氧诱导因子1（HIF-1）是参与缺氧调节的核心因子,可调控一系列缺氧诱导基因的表达,与机体许多生理和病理过程也密切相关。尽管一些研究显示缺氧和非缺氧性刺激可通过PI3K/Akt/mTOR信号途径诱导HIF-1的表达和活性,PI3K信号途径是否参与对HIF-1的调节仍然是个有争议的研究热点。明确HIF-1和PI3K的相互作用关系,能进一步为肿瘤等相关疾病的防治提供新的思路和方法。本文主要就HIF-1和PI3K/Akt/mTOR关系作一简要综述。     

紫丁香苷调控PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡的研究

目的 研究紫丁香苷的抗乳腺癌作用及分子机制，为紫丁香苷的临床应用提供理论依据。方法 MTT检测紫丁香苷对乳腺癌细胞增殖的抑制作用；台盼蓝、TUNEL和Annexin V-FITC/PI染色检测细胞的凋亡状况，Western bolt检测Caspase-3的活化情况，判断细胞凋亡是否发生；检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）的表达，结合JC-1染色探讨紫丁香苷对线粒体凋亡途径的影响；运用PI3K激动剂Recilisib做对比，qRT-PCR和Western bolt检测紫丁香苷调控PI3K/Akt/mTOR通路诱导癌细胞凋亡的作用。结果 紫丁香苷对乳腺癌细胞的增殖具有时间和剂量依赖的抑制作用，能诱导癌细胞发生凋亡。进一步研究发现，紫丁香苷处理后，细胞内Caspase-3被激活，Bcl-2表达下降，线粒体膜电位明显丧失，PI3K、Akt和mTOR的mRNA与蛋白质水平表达无明显变化，但蛋白质磷酸化水平明显下降；Recilisib处理后部分抵消了紫丁香苷对乳腺癌细胞凋亡的作用。结论 紫丁香苷对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7具有良好的抑制作用，其通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化来抑制细胞增殖并诱导细胞发生线粒体途径的凋亡。紫丁香苷是具有开发潜力的抗乳腺癌药物。     

NO信号途径在17β-雌二醇抑制大鼠VSMC ET-1生成中的作用

目的:用培养的血管平滑肌细胞(VSMC)探讨17β-雌二醇抑制内皮素-1(ET-1)生成的机制。方法:分别给予不同浓度的17β-雌二醇(10-9～10-7mol/L)或加入L-NAME作用VSMC不同时间,利用放免法测定ET-1的含量;同时检测ECE-1的活性以及preproET-1mRNA的表达。结果:17β-雌二醇可抑制基础状态下VSMCET-1的生成,其作用与ECE-1活性的改变无关;L-NAME可抑制17β-雌二醇的作用;RT-PCR结果显示,17β-雌二醇可以抑制preproET-mRNA的表达,而L-NAME可逆转17β-雌二醇所致preproET-1 mRNA表达的下降。结论:在基础状态下,17β-雌二醇可抑制VSMCET-1的生成,17β-雌二醇抑制ET-1的生成与ECE-1的活性改变无关,17β-雌二醇主要通过NO信号途径减低VSMCperproET-1 mRNA表达来抑制ET-1的生成。     

土槿皮乙酸通过PI3K/Akt信号通路诱导人肾癌细胞A498凋亡

目的:研究土槿皮乙酸对人肾癌细胞A498凋亡的影响,并探讨其内在的分子机制,为肾癌治疗寻找有效的新靶点和新策略。方法:人肾癌细胞A498经10、15μmol/L土槿皮乙酸处理48 h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡,同时通过Western印迹和实时荧光定量PCR检测凋亡相关蛋白和m RNA的表达;加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002或15μmol/L土槿皮乙酸处理A498细胞48 h后,Western印迹检测相关蛋白的表达。结果:经不同浓度土槿皮乙酸作用A498细胞48 h后,与未加土槿皮乙酸组细胞相比,细胞凋亡率显著上升,且呈剂量依赖性,比较差异有统计学意义(P0.05);同时,Blc-2表达减少,Bax、caspase-9、caspase-3表达增多。Blc-2蛋白的表达量随LY294002或土槿皮乙酸的逐步加入而减少,而Bax、caspase-9、caspase-3的表达呈增加趋势;PI3K和Akt蛋白的表达量与是否加入LY294002或土槿皮乙酸无关,p-PI3K和Aktp-Ser473蛋白的表达量随LY294002或土槿皮乙酸的逐步加入而减少。结论:土槿皮乙酸可抑制A498细胞凋亡,其作用机制可能与PI3K/Akt通路相关。     

Caveolin-1蛋白在17β-雌二醇抑制内皮素-1诱导血管平滑肌细胞增殖中的作用

本工作旨在研究Caveolin-1在17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)抑制内皮素-1(endothelin-1,ET-1)诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用.在培养的VSMCs上,使用[3H]Thymidine([3H]TdR)掺入法、荧光免疫组化方法和Western blot观察E2处理VSMCs前后ET-1对DNA合成和caveolin-1蛋白表达的影响.结果显示,ET-1可以刺激VSMCs增殖.E2作用24 h后,可明显抑制ET-1的上述作用.免疫荧光证实,在VSMCs上有caveolin-1分布,ET-1刺激VSMCs增殖的过程中,VSMCs上caveolin-1蛋白荧光强度下降,而事先给予E2可逆转这种下降.Western blot证实,ET-1可抑制caveolin-1蛋白的表达而E2则可增加caveolin-1蛋白的表达.以上结果表明E2抑制ET-l诱导的VSMCs增殖可能与其增加caveolin-1蛋白表达有关.     

FGFC1经PI3K/Akt/mTOR途径抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

FGFC1(Fungi fibrinolytic compound1)是从海洋长孢葡萄穗霉菌FG216中提取的一类具有良好生物活性的双吲哚化合物.然而,尚未有研究揭示其抗肿瘤活性.本研究探讨了 FGFC1对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的作用及其机制.首先,以不同浓度的FGFC1处理人非小细胞肺癌PC9细胞...     

Caveolin-1蛋白在171β-雌二醇抑制内皮素-1诱导血管平滑肌细胞增殖中的作用

本工作旨在研究Caveolin-1在17β-雌二醇（17β-estradiol,E2)抑制内皮素-1（endothelin-1,ET-1)诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs前后ET-1对DNA合成和caveolin-1蛋白表达的影响。结果显示,ET-1可以刺激VSMCs增殖。E2作用24h后,可明显抑制ET-1的上述作用。免疫荧光证实,在VSMCs上有cavellin-1分布,ET-1刺激VSMCs增殖的过程中,VSMCs上caveolin-1蛋白荧光强度下,而事称给予E2可逆转这种下降。Western bolt证实,ET-1可抑制caveolin-1蛋白的表达而E2则可增加caveolin-1蛋白的表达。以上结果表明E2抑制ET-1诱导的VSMCs增殖可能与其增加caveolin-1蛋白表达有关。     

雷公藤红素通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导食管癌细胞凋亡

越来越多的研究表明,雷公藤红素可以诱导细胞凋亡,但是其对食管癌细胞的作用尚未可知.该研究通过体外实验探讨了雷公藤红素对食管癌ECA-109细胞增殖和凋亡的影响,结果显示雷公藤红素对细胞增殖的抑制有明显的剂量依赖性,且在高浓度(≥1.0 mol/L)时细胞增殖受到明显抑制.雷公藤红素处理显著增加了Bax和p53的mRNA...     

17β雌二醇对大鼠血管平滑肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的研究17β雌二醇(E2)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响及其可能机制.方法应用流式细胞术检测不同浓度E2 (0-100nmol/L)在有或无血清状态下对传代VSMC凋亡及其相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响;并采用免疫荧光染色和共聚焦激光扫描荧光显微镜术对Bax的分布进行定位.结果在有或无血清条件下,当浓度达到10 nmol/L以上时,E2 引起VSMC Bax蛋白表达上升及Bax/Bcl-2比值的改变,并促进VSMC凋亡.这一效应有随E2剂量和作用时间增高的趋势.结论 E2可通过上调Bax蛋白表达而诱导VSMC凋亡.     

NEAT1通过PI3K/AKT/Bcl-2信号通路抑制骨质疏松

为探讨NEAT1在骨质疏松症中的作用以及可能的病理机制,本研究通过建立卵巢去势和鼠尾悬挂2种骨质疏松的小鼠模型,将C57BL/6分为假手术组(Sham组)、OVX组和TS组;经过PCR测定小鼠NEAT1的表达;Elisa法检测小鼠E2、ALP和TRACP水平;Western blotting检测细胞凋亡因子PI3K/AKT/Bcl-2的蛋白水平。结果显示,建模4周后,3组小鼠体重没有显著变化;与Sham组相比,OVX组和TS组小鼠的骨密度值显著降低,骨生化指标ALP和TRACR水平明显升高;OVX组小鼠的E2水平与Sham组相比明显降低;与Sham组相比,OVX组和TS组小鼠的NEAT1表达显著下调;与Sham组相比,OVX组和TS组小鼠p-AKT和Bcl-2蛋白水平明显降低。本研究结果表明,NEAT1可能通过抑制PI3K/AKT/Bcl-2细胞凋亡途径诱导骨质疏松。     

重楼活性单体pp-10通过抑制PI3K/Akt通路诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡和自噬

目的:探讨重楼/七叶一枝花(Paris polyphylla)的醇提物单体pp-10诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡和自噬及其分子机制。方法:采用MTT法和克隆形成抑制实验观察不同浓度的重楼单体pp-10对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用;Hoechst33342染色法检测pp-10作用于人胃癌BGC-823细胞后细胞核形态的改变;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western blotting检测重楼单体pp-10对细胞凋亡和自噬相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、Bax、Bcl-2、LC3、P62以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白(Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR、P70s6k、p-P70s6k)表达的影响。结果:重楼单体pp-10能显著抑制BGC-823细胞的生长,作用呈时间-效应关系及剂量-效应关系;克隆形成抑制实验表明随着pp-10浓度的增加,细胞克隆形成逐渐减少,与对照组相比有显著差异;在荧光显微镜下观察可见其细胞核固缩、边聚、裂解等细胞凋亡形态学变化;流式细胞术检测显示,随着作用药物浓度的增高,其凋亡率逐渐升高;Western blotting结果表明,随着药物浓度的增加,线粒体相关凋亡信号通路蛋白Caspase9、Caspase3及PARP均出现酶切活化条带,细胞促凋亡蛋白Bax的表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2减少,自噬相关蛋白Ⅱ型LC3增加,P62蛋白减少,p-Akt蛋白的表达水平下降,Akt下游蛋白p-m Tor、p-p70S6K表达减少。结论:重楼单体pp-10通过抑制BGC-823细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,与下调P13K/Akt信号通路有关。     

miR-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的作用及机制研究

目的:探讨mi R-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:首先构建慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,然后感染椎间盘退变髓核细胞得到稳定过表达细胞系,同时设置空载体和空白细胞组对照。用荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白GFP的表达,分别提取三组细胞总RNA,采用RT-q PCR方法检测mi R-155的表达;通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western-Blot检测细胞中凋亡相关蛋白FADD、Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达,JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化情况。结果:在荧光显微镜下,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白细胞组未见绿色荧光;RT-qPCR结果显示构建的稳定过表达细胞系(GV369-miR-155-NP)中mi R-155的表达水平较高,且与空载体细胞系及空白细胞对照组均呈显著性差异(P0.05);与空载体组(GV369-NP)及空白细胞对照组相比,过表达组(GV369-miR-155-NP)细胞凋亡率显著降低(P0.05),FADD、Caspase-3、Bax的表达水平均明显下降,而Bcl-2表达水平显著增加(P0.05)。结论:mi R-155可能通过靶向结合Caspase-3和FADD阻止FasL-Fas途径或通过线粒体途径抑制人椎间盘退变髓核细胞凋亡。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2(17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C17位点氧化17β-雌二醇,其Km值为0.082 mmol/L,Vmax值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。     

芒果苷通过PI3K/Akt/mTOR通路抑制缺氧缺血性脑损伤大鼠神经细胞凋亡及炎症反应

目的:探讨芒果苷抑制缺氧缺血性脑损伤大鼠神经细胞凋亡的机制。方法:将144只SD新生大鼠分为空白组、模型对照组、阳性对照组(尼莫地平,0.4 mg·kg~(-1)·d~(-1))、芒果苷低、中、高剂量组(50、100、200 mg·kg~(-1)·d~(-1))。检测脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)水平、细胞凋亡率、PI3K/Akt/mTOR通路分子表达量。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠脑组织中SOD的含量显著降低、细胞凋亡率显著增加,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量显著减少(P0.05);与模型组比较,芒果苷低、中、高剂量组大鼠脑组织中SOD的含量显著增加,细胞凋亡率均显著减少,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量显著增加且芒果苷剂量越大,上述变化越显著(P0.05)。结论:芒果苷对缺氧缺血性脑损伤大鼠的细胞凋亡及炎症反应具有抑制作用且该抑制作用与抑制PI3K/Akt/mTOR通路有关。     

抑制PI3K信号通路促进TRAIL诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)对癌细胞有独特的细胞毒性作用,而对正常细胞没有影响.但乳腺癌细胞耐受TRAIL诱导凋亡.本研究探索磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号通路对人乳腺癌MCF-7细胞耐受TRAIL的影响.采用MTT法、显微照相以及DAPI染色观察TRAIL对MCF-7细胞生长的抑制作用以及诱导细胞凋亡状况;流式细胞分析细胞凋亡的情况;激光共聚焦显微镜观察多聚ADP核糖多聚酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)的迁移和定位;Western印迹分析死亡受体、caspase-3/8、磷酸化的AKT[pAKT(Ser473)]、Src和PARP-1等蛋白质表达.结果显示,小剂量TRAIL(80 nmol/L)和Ly294002(40μmol/L)对MCF-7细胞生长没有显著的抑制作用,但是大剂量TRAIL(160 nmol/L)和Ly294002(80μmol/L)则能抑制MCF-7细胞生长;低剂量Ly294002协同TRAIL抑制MCF-7细胞生长,并诱导细胞凋亡;Ly294002和TRAIL共同作用能促进PARP-1从胞浆进入细胞核;蛋白质表达分析显示,MCF-7细胞均表达死亡受体DR4、DR5、诱骗受体DcR1和DcR2、以及caspase-8,但是不表达caspase-3;Ly294002和TRAIL共同作用也能抑制pAKT(Ser473)和Src的表达,并且导致PARP-1断裂.本研究结果提示,抑制PI3K信号可增加MCF-7细胞对TRAIL诱导的敏感性;MCF-7细胞通过PI3K/AKT途径促进Src的表达耐受TRAIL的细胞毒性作用;Ly294002联合TRAIL是一种新的药物组合方式治疗乳腺癌.     

抑制PI3K信号通路促进TRAIL诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）对癌细胞有独特的细胞毒性作用,而对正常细胞没有影响. 但乳腺癌细胞耐受TRAIL诱导凋亡.本研究探索磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）信号通路对人乳腺癌MCF-7细胞耐受TRAIL的影响. 采用MTT法、显微照相以及DAPI染色观察TRAIL对MCF-7细胞生长的抑制作用以及诱导细胞凋亡状况;流式细胞分析细胞凋亡的情况;激光共聚焦显微镜观察多聚ADP核糖多聚酶-1（poly(ADP-ribose) polymerase -1,PARP-1）的迁移和定位;Western印迹分析死亡受体、caspase-3/8、磷酸化的AKT［pAKT(Ser473)］、Src和PARP-1等蛋白质表达. 结果显示,小剂量TRAIL（< 80 nmol/L）和Ly294002（< 40μmol/L）对MCF-7细胞生长没有显著的抑制作用,但是大剂量TRAIL（160 nmol/L）和Ly294002（80 μmol/L）则能抑制MCF-7细胞生长;低剂量Ly294002协同TRAIL抑制MCF-7细胞生长,并诱导细胞凋亡;Ly294002和TRAIL共同作用能促进PARP-1从胞浆进入细胞核;蛋白质表达分析显示,MCF-7细胞均表达死亡受体DR4、DR5、诱骗受体DcR1和DcR2、以及caspase-8,但是不表达caspase-3;Ly294002和TRAIL共同作用也能抑制pAKT(Ser473)和Src的表达,并且导致PARP-1断裂. 本研究结果提示,抑制PI3K信号可增加MCF-7细胞对TRAIL诱导的敏感性;MCF-7细胞通过PI3K/AKT途径促进Src的表达耐受TRAIL的细胞毒性作用Ly294002联合TRAIL是一种新的药物组合方式治疗乳腺癌.