体外培养的小梁细胞表达水通道蛋白-1

目的观察体外培养条件下的牛眼小梁细胞(bovine trabecular meshwork cell,BTMC)是否表达水通道蛋白-1(Aquaporin-1,AQP-1)。方法采用免疫组织化学方法检测AQP-1在BTMC上的表达,并进行半定量分析。结果正常BTMC可见AQP-1蛋白表达,其灰度值为:167.94±1.18;阴性对照为:195.64±1.62,统计学分析其差异具有显著性(P<0.05)。结论在体外培养条件下,BTMC表达AQP-1,这有助于在体外条件下研究房水流出阻力、并探讨青光眼的药物治疗。     

解磷黑曲霉L-1菌株原生质体诱变育种

以从龙泉山地区酸性红壤中分离的黑曲霉L-1(Aspergillus niger sp.L-1)为出发菌株,通过研究菌株L-1原生质体的形成和再生条件,发现培养30 h的菌丝体在以0.15 mol/L氯化钾为渗透压稳定剂的基本培养基上经过再次培养20 h后,所得菌丝体用0.3%纤维素酶和0.4%蜗牛酶在30 ℃条件下处理...     

玉米生物钟基因ZmPRR1-2的克隆及表达分析

为探究玉米生物钟基因ZmPRR1-2的功能及表达特性,解析玉米光周期途径调控开花的机理,该研究以玉米骨干自交系‘黄早4’为材料,克隆ZmPRR1-2基因的cDNA序列并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析和48 h的昼夜节律表达分析。结果表明：(1)成功克隆获得ZmPRR1-2基因的编码区全长1 554 bp,编码517个氨基酸,编码的蛋白属于PRR基因家族,含有1个REC结构域和1个CCT结构域,多序列比对和系统进化分析显示ZmPRR1-2基因在禾本科植物中高度保守;ZmPRR1-2蛋白属亲水性蛋白,不包含跨膜结构域和信号肽。(2)ZmPRR1-2基因在玉米叶片中的表达量最高,显著高于其他7个组织,表明该基因主要在叶片中发挥功能,而在果穗和花丝中表达量相对较低,且显著低于雄穗中的表达量。(3)昼夜节律表达分析显示,在短日照条件下,ZmPRR1-2基因的表达量于光照3 h后开始逐渐上升,在光照结束后3 h时达到表达高峰;在长日照条件下,于光照6 h后ZmPRR1-2基因的表达量才开始逐渐上升,且在光照结束时达到表达高峰。研究认为,ZmPRR1-2基因...     

产PCA基因工程菌M18G反复补料分批培养研究

吩嗪-1-羧酸(PCA)是一种广谱、高效的微生物源农药,采用反复补料分批培养工艺可提高PCA合成速率,为实现PCA的商业化生产打下了良好的基础。本试验针对高产PCA的基因工程菌M18G,首先在摇瓶培养条件下,用正交试验法研究了培养基中各主要营养因子葡萄糖、黄豆粉、甘油、95%乙醇等对PCA产量的影响,并确定了适合PCA分泌的最佳培养基(1L)为:葡萄糖6g,黄豆粉40g,甘油6mL,95%乙醇5.9mL;然后确定了反复补料分批培养时更换新鲜培养基的最佳时间为每次培养进行48h后、体积比例为90%。在此条件下,培养进行五个周期后,PCA的合成速率可达到2.27mg/h,是优化后分批培养的1.34倍,同时延长了培养周期,有利于提高设备使用率,降低生产成本。     

温度对假单胞菌rsmA突变株M-18R合成Plt和PCA的区别性影响

次生代谢物阻遏蛋白 (Repressorofsecondarymetabolite ,Rsm)A是一种全局性调控因子 ,与Mrna的RBS结合 ,转录后水平上抑制基因翻译。运用同源重组技术 ,构建了假单胞菌 (Pseudomonas sp .)M-18的rsmA突变菌株M-18R。在 37℃、28℃恒温和短期升温 (37℃、4h培养 ,转 28℃继续培养 )条件下 ,比较野生株M-18和突变株M_18R生物合成藤黄绿菌素 (Plt)和吩嗪-1-羧酸 (PCA)的量。在 37℃条件下 ,M-18和M-18R合成这两种抗生物质的能力几乎受到完全抑制。在28℃条件下 ,M-18R合成Plt的量约为野生型M-18的 10倍 ,达到 270 μg /Ml ,但是合成PCA的量仅为野生型的 50%。经短期升温培养 ,M-18的Plt合成量明显下降 ,PCA产量降低不显著 ;相反 ,M-18R合成Plt的量达到 400μg/Ml ,但PCA产量的变化仍不明显。推测 ,M-18菌株细胞内存在着某种与RsmA相关联的温度敏感因子 ,在RsmA缺失条件下 ,作为专一性激活剂促进Plt的生物合成 ,但是 ,并不参与对PCA合成的调控。     

大鼠心肌缺血再灌注损伤模型线粒体自噬变化的研究

目的:观察大鼠心肌缺血再灌注损伤模型不同时间点线粒体及线粒体自噬的变化。方法:成年雄性SD大鼠40只,随机分为假手术对照组(sham组):开胸不进行冠状动脉左前降支(Left anterior descending coronary artery,LAD)血流阻断;缺血再灌注组2h组(I/R 2 h组)、24 h组(I/R 24 h组)及48 h组(I/R 48 h组),以上3组均阻断LAD 30 min,分别于再灌注后2 h、24 h、48 h观察心肌ATP含量,线粒体膜电位水平变化,透射电镜下观察线粒体及线粒体自噬超微结构变化,western blot法测定线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin、p62、LC3B及线粒体膜蛋白Tom20表达水平。结果:与对照组相比,线粒体膜电位水平及心肌组织ATP含量于再灌注2 h开始下降,24 h下降最显著,48 h有所改善,线粒体超微结构损伤再灌注24 h最为明显,48 h有所改善。PINK1、Parkin、p62蛋白表达于损伤后2 h增强,于再灌注后24 h升高最显著,持续至48 h,LC3BⅡ表达于损伤后24 h增强,同样持续至48 h。透射电镜下可见线粒体自噬体于再灌注后24 h明显增多,并持续至48 h。结论:大鼠心肌缺血再灌注损伤后,线粒体功能与形态损伤以损伤后24 h最为显著,至损伤后48 h后好转;线粒体自噬水平升高以损伤后24 h最为显著,且维持至损伤后48 h,提示两者之间可能存在关联。     

姜黄素后处理通过SIRT1/FOXO1信号通路拮抗小鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探究姜黄素后处理是否通过激活SIRT1/FOXO1信号通路抵抗小鼠脑缺血再灌注损伤。方法:小鼠脑缺血30 min,再灌注24 h建立脑缺血再灌注模型。手术前脑室内注射SIRT1特异性抑制剂EX527。再灌注后腹腔注射姜黄素。小鼠随机分为以下6组:假手术组;单纯姜黄素后处理组;缺血再灌注组;缺血再灌注+姜黄素后处理组;EX527预处理+缺血再灌注+姜黄素后处理组;EX527预处理+脑缺血再灌注组。再灌注24 h检测脑梗体积、Complex I活性、ROS含量以及SIRT1、Ac-FOXO1、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况。结果:与手术组相比,姜黄素后处理组梗死区脑组织SIRT1的表达量及活性明显增加,脑梗体积降低,ROS含量降低而Complex I活性增高,Bcl-2的表达增高而Bax和Caspase-3的表达量降低(均P0.05)。阻断SIRT1信号通路后上述姜黄素脑保护作用均减弱(P0.05)。结论:我们的研究首次证实姜黄素后处理通过激活SIRT1/FOXO1信号通路,进而降低氧化应激与凋亡,最终减轻脑缺血再灌注损伤。     

minTBP-1/IGF-1融合蛋白钛涂层对高糖高脂环境下成骨细胞分化活性的影响

目的:评价自行设计的minTBP-1与IGF-1融合蛋白涂层修饰的纯钛表面对高糖高脂环境下成骨相关基因及蛋白表达的影响。方法:借助互联网Prot Param工具设计并筛选出亲水性较高的minTBP-1与IGF-1融合蛋白,用于修饰钛表面,分别将正常成骨细胞和高糖高脂环境下培养的成骨细胞接种于其表面,以钛表面无涂层的正常成骨细胞为对照组,通过碱性磷酸酶(ALP)、茜素红S染色及定量,比较成骨细胞的生物学特性;1周、2周时,Real-time PCR检测成骨细胞ALP、Ι型胶原、Runx2和OCN基因表达水平的变化;1周、2周和3周时,Western Blot分别检测成骨细胞ALP、OCN蛋白的表达量。结果:高糖高脂环境下培养的成骨细胞扁平、呈不规则多边形,其ALP的表达、钙化结节形成均低于正常成骨细胞(P0.05)。高糖高脂环境下,在目标融合蛋白修饰的钛表面接种成骨细胞1周时,ALP基因及蛋白均有明显表达,与正常成骨细胞相比无统计学差异(P0.05);2周时Ι型胶原、Runx2以及OCN的基因明显高表达,第3周时OCN蛋白显著表达,与正常成骨细胞相比无统计学差异(P0.05)。结论:minTBP-1与IGF-1融合蛋白涂层修饰的纯钛表面有利于改善高糖高脂环境下成骨细胞的生物学活性、促进了成骨相关基因及蛋白的表达,有望为2型糖尿病条件下钛-骨结合的种植体表面改性提供新策略。     

NSCLC中低氧诱导因子-1α对血管生成素-2表达的影响

目的探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible fac-tor-1α,HIF-1α)对血管生成素-2(angiopoietin-2)表达的影响及意义。方法免疫组化SP法检测46例NSCLC组织HIF-1α、血管生成素-2蛋白的表达;培养人肺腺癌细胞株A549细胞,CoCl2模拟缺氧处理6h、12h、24h,以及缺氧条件下不同浓度genistein处理细胞12h后,采用Western Blot和RT-PCR方法分别检测A549细胞HIF-1α蛋白和血管生成素-2 mRNA的表达情况。结果46例NSCLC中HIF-1α、血管生成素-2的阳性表达率分别为73.9%(34/46)、63.0%(29/46),明显高于癌旁肺组织(P<0.05);HIF-1α的表达与血管生成素-2的表达呈正相关。急性缺氧可以诱导A549细胞HIF-1α蛋白和血管生成素-2 mRNA表达增加,分别在6h,12h达到高峰,随着缺氧时间延长,HIF-1α蛋白和血管生成素-2 mRNA表达相对减少;genistein抑制HIF-1α蛋白后,血管生成素-2 mRNA的表达也相应减少,呈浓度依赖。结论缺氧时NSCLC中HIF-1α可参与血管生成素-2的调控,HIF-1α、血管生成素-2表达增加与肿瘤新生血管形成有关,二者共同促进NSCLC的发生发展过程。     

葛根素对腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞分泌TGF-β1的影响

目的:了解葛根素对腹膜透析液干预下的体外培养人腹膜间皮细胞分泌转化生长因子β1(TGF-β1)的影响.方法:体外培养的人腹膜间皮细胞,分对照组、PDS组、A组(葛根素终浓度为50μg/mL)、B组(葛根素终浓度为100μg/mL)、C组(葛根素终浓度为200μg/mL)五组观察.检测各组上清液中TGF-β1的含量并比较.结果:腹膜间皮细胞在PDS干预下,TGF-β1分泌显著增加,添加葛根素再干预的A、B、C组TGF-β1分泌与PDS组比较有显著下降.结论:葛根素对腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞分泌致纤维化因子TGF-β1具有抑制作用.     

温度对假单胞rsmA突变株M-18R合成Plt和PCA的区别性影响

次生代谢物阻遏蛋白(Repressor of secondary metabolite,Rsm)A是一种全局性调控因子,与mRNA的RBS结合,转录后水平上抑制基因翻译。运用同源重组技术,构建了假单胞茵(Pseudomonas sp．)M-18的rsmA突变菌株M-18R。在37℃、28℃恒温和短期升温(37℃、4h培养,转28℃继续培养)条件下,比较野生株M-18和突变株M-18R生物合成藤黄绿菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)的量。在37℃条件下,M-18和M-18R合成这两种抗生物质的能力几乎受到完全抑制。在28℃条件下,M-18R合成P11的量约为野生型M-18的10倍,达到270μg／mL,但是合成PCA的量仅为野生型的50％。经短期升温培养,M-18的Plt合成量明显下降,PCA产量降低不显;相反,M-18R合成Plt的量达到400μg／mL,但PCA产量的变化仍不明显。推测,M-18菌株细胞内存在着某种与RsmA相关联的温度敏感因子,在RsmA缺失条件下,作为专一性激活剂促进Plt的生物合成,但是,并不参与对PCA合成的调控。     

羰基还原酶产生菌Candida ontarioensis制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇

从实验室保藏的菌株中筛选获得Candida sp.PT2A,并通过18S rRNA鉴定为安大略假单胞菌Candida on-tarioensis。对C.ontarioensis不对称还原合成(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的发酵产酶条件和转化条件进行优化,确定了最适的发酵产酶条件和转化条件:温度30℃,初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,菌体质量浓度200 g/L。采用2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮质量浓度为10 g/L时,还原反应72 h,(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的e.e.值为99.9%,产率为99%;底物质量浓度提高至30 g/L时,产率下降为84.3%。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对C.ontarioensis细胞进行通透性处理(CTAB g/L,4℃下处理20 min),在30 g/L底物下反应24 h,产物的e.e.和产率分别达到99.9%和97.5%。     

MicroRNA-9-1促进大鼠表皮干细胞分化为神经细胞

目的:探讨MicroRNA-9-1在体外诱导大鼠表皮干细胞向神经细胞分化过程中的作用。方法:构建大鼠MicroRNA-9-1慢病毒载体,并感染SD大鼠的表皮干细胞;实验分为感染组、未感染组和阴性对照组;采用β-巯基乙醇诱导感染后的SD大鼠表皮干细胞分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察表皮干细胞感染后GFP荧光表达的情况;免疫细胞化学染色检测神经微管结合蛋白2(MAP-2)的表达水平;RT-PCR检测MAP-2mRNA的表达水平。结果:阳性克隆PCR检测证明大鼠MicroRNA-9-1慢病毒载体构建成功;感染后48 h,在倒置显微镜下观察到,感染组GFP荧光表达达到峰值,感染效率达到了(85.6±1.9)%;β-巯基乙醇诱导7 h时,感染组大部分表皮干细胞向神经细胞分化,且诱导效果显著好于未感染组和阴性对照组;MAP-2在蛋白((87.3±0.6)%)和mRNA水平(约2倍)的表达率显著高于其他各组(P0.05)。结论:MicroRNA-9-1慢病毒载体可以高效感染大鼠表皮干细胞,且可以促进表皮干细胞在β-巯基乙醇的诱导下向神经细胞分化。     

诱变筛选荧光假单胞菌M18高产吩嗪-1-羧酸(PCA)菌株及发酵条件研究

研究了亚硝基胍(NTG)的诱变剂量、处理时间以及氯化钠浓度对野生型荧光假单胞菌M18存活率的影响,NTG的诱变剂量25～200mg／L,处理时间10～30min范围内,随着诱变剂剂量增加和时间的延长,M18的存活率不断下降。NTG的作用剂量25mg／L,处理时间10min时,细菌存活率为55％左右。利用细菌存活率为55％时的诱变条件,经生物测定,初筛获得20株抑菌效果明显的诱变株。经摇瓶发酵复筛,从这20株诱变株中,获得PCA高产诱变株M18N07。并对此菌株发酵条件进行调整,较理想的培养条件为：蛋白胨18g／L,葡萄糖16g／L,氯化钠1g／L,硝酸钾10g／L。小瓶培养时间17h,大瓶5％接种量,28℃培养54h。     

热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响

研究了热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响。通过正交试验确定了热激的最佳条件:热激在产酶初期(培养20 h)进行,热激时培养温度由20℃升高至30℃,处理时间30 min。在此条件下,海藻糖合成酶的酶活提高了76%。同时在热激后菌体的耐盐性也有较大增强。     

低氧处理不同时间对人肺腺癌A549细胞增殖的影响 及相应缺氧模型探讨*

目的:观察低氧处理不同时间对人肺腺癌A549细胞增殖的影响,探讨合理的人肺腺癌细胞株A549体外模拟缺氧时间。方法:将人肺腺癌细胞A549细胞株在低氧环境下分别培养12 h、24 h、48 h、72 h,设置常氧对照组,通过CCK8法测定A549细胞存活率,RT-PCR和免疫印迹分别检测细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)mRNA及蛋白的表达。结果:低氧24 h组A549细胞存活率最高,低氧48 h、72 h组A549细胞存活率呈时间依赖性明显下降(P0.001)。自低氧12 h起,A549细胞HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表达开始随低氧时间延长而显著增加(P均0.001);HIF-1α和VEGF蛋白表达自24 h开始随低氧时间延长而显著增加(P均0.001)。结论:低氧诱导的A549细胞存活率呈时间依赖性降低,而HIF-1α、VEGF表达呈时间依赖性增高,人肺癌细胞株A549缺氧模型最适时间为24 h。     

黑曲霉X-1产木聚糖酶液体发酵工艺研究

目的:提高黑曲霉X-1菌株液体发酵木聚糖酶的产量.方法:采用单因素和正交试验对黑曲霉X-1菌株产木聚糖酶液体发酵培养基和培养条件进行了优化.结果:通过正交试验找出最大影响因素为玉米芯和葡萄糖的供应,优化后的最佳培养基和培养条件为:玉米芯粉3%,葡萄糖0.5%,蛋白胨1%,KH2PO4 0.5%,MgSO4·7HO 0.1%,Tween-80 0.‰,pH 6.5,30℃、200r/min摇瓶培养120h.结论:黑曲霉X-1菌株在优化后的培养基和培养条件下,木聚糖酶活力高达1 630.78U,比优化前木聚糖酶活力(724.63U)提高了125.05%.     

三氧化二砷对人脐静脉内皮细胞凋亡及VCAM-1/ICAM-1 表达的影响

目的:观察三氧化二砷(As2O3)对血管内皮细胞增殖、凋亡及VCAM-1/ICAM-1表达的影响,探讨As2O3对血管内皮细胞增殖生长以及炎症反应的影响。方法:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养,以不同As2O3浓度及时间对其进行干预。采用CCK-8测定细胞增殖活性,流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR检测VCAM-1mRNA表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞间黏附分子(VCAM-1)及血管细胞黏附分子(ICAM-1)的表达情况。结果:当As2O3浓度在3μmol.L-1时HUVEC培养24 h的的凋亡率为(0.134±0.03)%,48 h为(3.305±0.53)%,72 h为(3.748±0.84)%(P<0.05),凋亡率均在一较低水平。当As2O3浓度>3μmol.L-1时HUVEC凋亡率明显增加(P<0.01)。不同浓度As2O3作用HUVEC48 h后检测上清液中ICAM-1与VCAM-1浓度时发现1μmol.L-1时VCAM-1表达即开始增加(123.32±3.78 mmol.L-1,P<0.01),而HUVEC表达ICAM-1含量与对照组相比差异并不明显(38.94±2.59 mmol.L-1,P>0.05),随着As2O3浓度的增加,HUVEC表达ICAM-1/VCAM-1的量均增加但敏感性不同。对照组及(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0)μmol.L-1As2O3作用于HUVEC 48 h实时荧光定量PCR法检测VCAM-1mRNA表达量明显增加,与对照组相比实验组的表达量分别为(1.657±0.287,1.858±0.241,2.321±0.280,3.012±0.235,3.508±0.342)(P<0.01)。结论:As2O3可直接降低细胞活性,诱导细胞凋亡,并且呈一定的时间-浓度依赖性。在较低浓度时VCAM-1/ICAM-1的表达在一个相对较低的水平,随着As2O3浓度的逐渐升高,内皮细胞凋亡率增高,VCAM-1/ICAM-1表达增加,并且VCAM-1/ICAM-1对As2O3的敏感性呈现一定的差异性。     

MicroRNA-495对人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:探讨MicroRNA-495(miR495)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响。方法:体外分离培养HUVECs,将HUVECs铺至6孔板中,待细胞融合至80%时,将miR495模拟物(miR495 mimics)、miR495抑制剂(miR495 inhibitor)及其相应的对照negative control(NC)、inhibitor NC分别转染到6孔板的HUVECs中,于转染后不同时间点(12 h、24 h和48 h)收集细胞进行RNA及蛋白提取。荧光定量PCR方法检测HUVECs中miR495及ICAM-1基因mRNA表达。Western blotting检测HUVECs中ICAM-1蛋白表达。结果:(1)与NC相比较,miR495 mimics组中miR495水平显著升高;与inhibitor NC组比较,miR495 inhibitor组中miR495表达明显下降。(2)与NC组比,miR495 mimics组明显降低HUVECs中ICAM-1的mRNA及蛋白表达;与inhibitor NC组比,而miR495 inhibitor组能显著增加HUVECs中ICAM-1的m RNA及蛋白表达。结论:MiR495能降低HUVECs中ICAM-1基因mRNA和蛋白表达。     

高氧抑制LPS/ATP诱导的骨髓源性巨噬细胞的焦亡

目的:研究不同浓度的氧气在LPS/ATP诱导的骨髓源性巨噬细胞焦亡中的作用。方法:提取C57BL/6小鼠的骨髓源性巨噬细胞,用1μg/ml脂多糖(LPS)刺激细胞24 h,用5 mM三磷酸腺苷(ATP)刺激细胞4 h,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞培养上清液中IL-1β水平的变化。用5 mM ATP刺激细胞后,给予细胞40%、60%和100%的氧气处理1.5 h,ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β水平的变化。结果:1μg/mL LPS和5 mM ATP先后刺激下,骨髓源性巨噬细胞培养上清液中IL-1β的水平明显升高(P0.001),用caspase-1特异性抑制剂AC-YVAD-CMK刺激骨髓源性巨噬细胞后IL-1β水平明显降低(P0.001)。5 mM ATP刺激之后给予细胞不同浓度的氧气干预1.5 h后,细胞培养上清液中IL-1β的水平明显下降。结论:高氧抑制LPS/ATP诱导的骨髓源性巨噬细胞的焦亡。