鼻咽癌细胞中S100A8与S100A9基因的克隆及其质粒构建和表达

我们发现S100A8和S100A9蛋白质不仅在鼻咽癌患者血浆中水平高于健康人,而且在鼻咽癌组织及培养细胞中也存在高表达。本研究的目的是在鼻咽癌细胞中克隆S100A8和S100A9基因并构建表达质粒和在鼻咽癌细胞中表达,为内源性S100A8和S100A9蛋白质与鼻咽癌发生发展的关系研究奠定基础。PCR扩增目的基因S100A8和S100A9片段,将其插入载体p Bud CE4.1构建S100A8-S100A9-p Bud CE4.1表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后转染至人鼻咽癌细胞系(CNE1)进行表达并用Real time-PCR及Western Blot进行检测。PCR、双酶切和测序结果显示,S100A8和S100A9氨基酸序列无变异(S100A8有1个碱基突变),表达质粒S100A8-S100A9-p Bud CE4.1构建正确。Real Time-PCR和Western Blot结果显示,S100A8和S100A9基因在CNE1中正确转录与表达。成功克隆S100A8和S100A9基因并构建S100A8-S100A9-p Bud CE4.1表达质粒且可在鼻咽癌细胞中稳定表达。     

S100A9参与乙型肝炎病毒X蛋白介导的HepG2细胞增殖与迁移

目的:探讨S100A9在乙型肝炎病毒X(HBx)介导的HepG2细胞增殖及迁移中的作用。方法:用表达HBx蛋白的重组腺病毒AdHBx感染HepG2细胞后,用CCK-8实验检测细胞增殖能力及划痕愈合实验检测细胞迁移能力;在HepG2/AdHBx细胞中转染S100A9-siRNA及其对照siRNA后,检测HepG2细胞增殖及迁移能力;在HepG2/Ad HBx和对照组HepG2/AdGFP细胞中,采用Real-time PCR及Western Blot检测S100A9基因及蛋白的表达情况;在HepG2/AdHBx细胞中,加入不同剂量的NF-κB抑制剂BAY11-7082后,检测各组中S100A9的基因及蛋白表达情况。结果:HBx促进HepG2细胞的增殖与迁移; S100A9-siRNA抑制S100A9的表达后,HBx促进HepG2细胞的增殖与迁移的作用降低,HBx介导的HepG2细胞的增殖与迁移部分依赖于S100A9; S100A9基因及蛋白表达在HepG2/AdHBx中较对照组HepG2/Ad GFP显著升高,HBx可致S100A9表达增加;抑制NF-κB转录活性后,AdHBx+BAY11-7082组S100A9基因及蛋白表达较对照组显著降低,阻断NF-κB转录活性可部分抑制HBx调控的S100A9表达。结论:HBx可调控S100A9的表达且与NF-κB活化有关,S100A9参与HBx介导的HepG2细胞的增殖与迁移。     

S100A9促进肝癌细胞HepG2的存活与侵袭依赖于RAGE

目的:探讨S100A9对人肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响及可能机制。方法:采用免疫组织化学法与Western blot方法检测人肝癌组织与癌旁组织中S100A9蛋白表达水平;原核表达重组蛋白的方法构建重组蛋白GST-S100A9,用GST-S100A9处理肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L02,然后用MTT法检测细胞存活能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力;Western blot方法检测肝癌细胞HepG2与肝正常细胞L02中晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达水平。结果:S100A9在人肝癌组织中的表达较癌旁组织显著增高;GST-S100A9可以促进肝癌细胞HepG2的存活与侵袭,但对肝正常细胞L02无作用;RAGE的表达在HepG2细胞中较在L02细胞中显著升高;RAGE阻断抗体可阻断GST-S100A9对HepG2细胞的促存活与促侵袭作用,表明这些作用是通过RAGE介导的。结论:S100A9促进肝癌细胞HepG2的存活与侵袭依赖于RAGE。     

人CXCL9重组腺病毒的制备及其表达产物生物活性检测

目的构建携带人CXCL9基因的重组腺病毒,分析其表达产物的生物学活性。方法采用PCR法从pBLAST2-hCXCL9质粒上扩增出hCXCL9基因,再将其克隆至pENTR11载体上,构建pENTR11-hCXCL9质粒,通过同源重组将hCXCL9基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后在293A细胞内进行包装、扩增后得到携带hCX-CL9基因的重组腺病毒。用包装好的病毒感染Hela细胞,分析目的基因的表达及其生物学活性。结果成功地将hCXCL9基因片段克隆至重组腺病毒载体上,并经293A细胞包装出病毒颗粒。该病毒感染Hela细胞后,可在培养上清液中检测到显著表达的hCXCL9。通过趋化活性分析发现,该表达产物对T淋巴细胞具有明显的趋化活性。结论成功构建了hCXCL9重组腺病毒,并可在体外高效表达具有生物活性的目的产物。     

人类S100A8/A9基因的转录调控

S100蛋白以其在中性条件下能溶解于100%饱和硫酸铵中而得名,是一个酸性的钙离子结合蛋白家族。S100A8和S100A9均为S100蛋白家族成员。S100A8/A9形成的异源二聚体蛋白即钙卫蛋白,在抗感染、抗肿瘤等过程中发挥了重要的功能。S100A8/A9基因启动子受许多转录因子如C/EBPα、C/EBPβ等的调控。炎性因子如白细胞介素、干扰素γ、肿瘤坏死因子α、脂多糖等可以上调S100A8/A9基因的表达,众多的细胞信号通路也参与了S100A8/A9基因的表达调控。表观遗传因素在S100A8/A9基因的表达过程中也发挥了重要的调控作用。本文概述了人类S100A8/A9基因的转录调控进展,对该领域的研究趋势进行了展望。     

S100A9在肿瘤方面的研究进展

S100A9是钙结合蛋白8100蛋白家族中重要的成员之一,其参与炎症反应、调节细胞生长分化、生长抑制、诱导细胞凋亡等,近年来研究发现S100A9时肿瘤的生长、增殖及侵袭有着重要作用,可能会成为肿瘤诊治的新靶点.基于上述思路,本文拟对S100A9与肿瘤的关系进行简要综述.     

S100A9参与介导具核梭杆菌促结肠癌细胞的增殖与迁移的作用 *

目的:探讨S100A9在具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)促结肠癌HCT116和SW480细胞增殖与迁移中的作用。方法:Fn感染HCT116和SW480细胞后,分别采用CCK8实验及Transwell实验检测结肠癌细胞的增殖及迁移能力的变化,采用Real time PCR及Western blot分别检测S100A9基因及蛋白质水平的变化;用S100A9 siRNA转染HCT116和SW480细胞后感染Fn,采用CCK8实验及Transwell实验分别检测两株细胞增殖及迁移能力的变化;利用NF-κB抑制剂BAY 11-7082预处理HCT116和SW480细胞后再感染Fn,采用Real time PCR及Western blot分别检测S100A9基因及蛋白质水平的变化。结果:(1)Fn可促进HCT116和SW480细胞增殖及迁移(P<0.001); (2)Fn感染的HCT116和SW480细胞中S100A9基因及蛋白质水平均较相应对照组明显升高,差异均具有高度显著性(P<0.01或P<0.001),即Fn上调S100A9的表达;(3)用S100A9 siRNA下调HCT116和SW480细胞中S100A9表达后,Fn促进这两株细胞增殖及迁移的作用则明显减弱,差异均具有高度显著性(P<0.001),表明S100A9参与介导Fn的促HCT116和SW480细胞增殖及迁移的作用; (4)在NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082预处理的HCT116和SW480细胞组,Fn上调S100A9基因及蛋白质水平的作用明显被逆转,差异均具有高度显著性(P<0.01或P<0.001),表明激活NF-κB转录活性是Fn上调S100A9的机制之一。结论:Fn可上调S100A9表达且与NF-κB活化有关,上调S100A9是Fn促结肠癌细胞增殖及迁移的机制之一。     

人钙结合蛋白S100A9基因克隆表达纯化及其对SH-SY5Y细胞作用的研究

钙结合蛋白S100A9在许多慢性疾病中聚集并可能在一些自身免疫性如老年痴呆中发挥了重要的作用。大量的报道也表明S100A9日益获得人们的注意。通过获取足量重组人S100A9蛋白,探索其对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的作用及机制。运用全基因合成法合成人S100A9基因,构建人S100A9原核表达重组质粒p ET28a-S100A9,经单酶切法及PCR法鉴定重组质粒已构建成功。利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在18℃、25℃、37℃分别诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定,结果显示18℃时蛋白大量表达于上清中,在37℃时大量表达于包涵体。采用镍亲和层析法分别纯化两种来源重组蛋白,透析后低温冻干获得蛋白粉。使用CCK-8法检测上清来源和包涵体来源的S100A9蛋白对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖抑制作用。结果显示两种来源重组蛋白对SH-SY5Y细胞具有生长抑制作用,在浓度为0.05 mg/m L时即有明显抑制作用(p0.01),且二者作用无明显差异(p0.01)。采用AO/EB双重染色和流式细胞术初步检测S100A9对SH-SY5Y细胞的增殖抑制机理,结果显示该蛋白可促进SH-SY5Y细胞的凋亡。两种来源蛋白之间的比较也显示二者对于SH-SY5Y细胞作用无明显差异(p0.05)。本研究成功获得足量S100A9重组蛋白,且两种来源S100A9蛋白作用于SH-SY5Y细胞的生物学效应一致。     

S100A8和S100A9通过Wnt/β-catenin通路影响鼻咽癌细胞生物行为的研究

为探讨S100A8和S100A9对鼻咽癌细胞系CNE2的影响及是否通过Wnt/β-catenin通路而发挥作用,以培养基添加1μg/m L S100A8/S100A9培养CNE2为实验组,采用划痕、黏附和平板克隆实验分别检测S100A8/S100A9对CNE2细胞的生物学行为影响,同时运用Western blotting检测CNE2细胞中β-catenin蛋白的累积。实验结果显示,S100A8/S100A9起促进CNE2细胞迁移(p0.05,p0.01)、基质黏附(p0.01)和平板克隆(p0.01)的作用,且添加S100A8/S100A9蛋白后1 h,CNE2细胞中β-catenin的累积明显上调。以上结果显示S100A8/S100A9可促进鼻咽癌细胞CNE2侵袭和迁移及细胞干性增强等生物学行为,其机制可能有Wnt/β-catenin通路的参与。     

S100A9参与介导具核梭杆菌促结肠癌细胞的增殖与迁移的作用

目的:探讨S100A9在具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)促结肠癌HCT116和SW480细胞增殖与迁移中的作用。方法:Fn感染HCT116和SW480细胞后,分别采用CCK8实验及Transwell实验检测结肠癌细胞的增殖及迁移能力的变化,采用Real time PCR及Western blot分别检测S100A9基因及蛋白质水平的变化;用S100A9 siRNA转染HCT116和SW480细胞后感染Fn,采用CCK8实验及Transwell实验分别检测两株细胞增殖及迁移能力的变化;利用NF-κB抑制剂BAY 11-7082预处理HCT116和SW480细胞后再感染Fn,采用Real time PCR及Western blot分别检测S100A9基因及蛋白质水平的变化。结果:(1) Fn可促进HCT116和SW480细胞增殖及迁移(P 0.001);(2) Fn感染的HCT116和SW480细胞中S100A9基因及蛋白质水平均较相应对照组明显升高,差异均具有高度显著性(P 0. 01或P 0. 001),即Fn上调S100A9的表达;(3)用S100A9 siRNA下调HCT116和SW480细胞中S100A9表达后,Fn促进这两株细胞增殖及迁移的作用则明显减弱,差异均具有高度显著性(P 0. 001),表明S100A9参与介导Fn的促HCT116和SW480细胞增殖及迁移的作用;(4)在NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082预处理的HCT116和SW480细胞组,Fn上调S100A9基因及蛋白质水平的作用明显被逆转,差异均具有高度显著性(P 0. 01或P 0. 001),表明激活NF-κB转录活性是Fn上调S100A9的机制之一。结论:Fn可上调S100A9表达且与NF-κB活化有关,上调S100A9是Fn促结肠癌细胞增殖及迁移的机制之一。     

S100A9对宫颈癌Hela细胞的增殖和迁移的影响及其机制探讨

为初步探讨S100A9在宫颈癌中的生物学作用,利用携带有人S100A9基因的腺病毒(Adh S100A9)感染于低表达S100A9的宫颈癌Hela细胞,通过MTT法检测细胞增殖能力,划痕愈合试验和Transwell试验检测细胞迁移能力,通过倒置显微镜观察细胞形态变化,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测上皮细胞标志蛋白E-钙黏着蛋白(E-cadherin,E-cad)、间质细胞标志蛋白波形蛋白(vimentin,Vim)及Wnt/β-联蛋白(β-catenin,β-cat)信号通路相关分子的表达。结果显示,与对照组相比,过表达S100A9的Hela细胞增殖活性增强、迁移率增高,细胞形态由"铺路石"样向"梭形"转变,排列紊乱,伴随E-cad降低(P0.05)和Vim升高(P0.01);同时,过表达S100A9的Hela细胞中Wnt/β-cat信号通路的关键分子β-联蛋白水平增加(P0.01),并且入核增多(P0.01),该通路的下游靶基因c-myc、Snail及Twist表达也明显上调。该研究结果提示,S100A9促进宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移和上皮–间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),激活Wnt/β-cat信号通路;S100A9促进增殖和迁移作用的机制可能与其促进EMT和激活Wnt/β-cat信号通路相关。     

S100A4原核表达载体的构建以及蛋白的表达和纯化

S100A4是S100蛋白家族的成员,在细胞的增殖、分化、损伤修复以及肿瘤细胞转移等方面发挥重要的调控作用.本研究将S100A4全长基因构建到pET28a原核表达载体上,利用大肠杆菌表达系统表达和纯化出高纯度的重组人S100A4.通过试验证明,重组人S100A4蛋白在体外可以有效地增强黑色素瘤细胞A375-S2的增殖.重组人S100A4原核表达与纯化方法的建立将促进其结构和生物学功能研究,并且对于S100蛋白家族其它蛋白的表达与纯化具有重要的参考意义.     

DNA核酸酶与猪链球菌9型毒力的关系

【目的】除了猪链球菌2型外,猪链球菌9型(SS9)也是目前流行血清型,同时也是人畜共患病原菌。前期研究发现,DNA核酸酶(Ssn A)存在于SS9毒力株中,在SS9无毒株中不存在。为明确Ssn A对SS9毒力的影响,本研究构建ssn A缺失株Δssn A,并研究其生物学功能。【方法】用穿梭质粒p SET-4s构建Δssn A,并通过斑马鱼毒力试验、HEp-2细胞黏附、猪全血存活和酶活检测等试验,评价Ssn A对SS9毒力的影响。【结果】斑马鱼毒力试验显示,Δssn A对斑马鱼毒力显著降低,半数致死量是野生株的11.2倍;Δssn A对HEp-2细胞的黏附率为野生株的60.61%;Δssn A在猪全血中的存活率为野生株的71.88%;酶活试验表明,Ssn A可降解线性和环状DNA。【结论】本研究表明SS9 Ssn A具有降解线性和环状DNA能力,该基因缺失后细菌对斑马鱼毒力、黏附HEp-2细胞能力、在猪全血中存活及分解DNA能力都显著降低,证实Ssn A是SS9的一个毒力因子。     

MMP9、S100A10基因沉默稳转小鼠细胞系的构建及验证

目的分别构建小鼠MMP9、S100A10沉默的稳转细胞系,并验证功能。方法构建能有效干扰S100A10、MMP-9表达的慢病毒LV-musMMP9-shRNA、LV-musS100A10-shRNA,将其转染293T细胞进行包装、扩增及质量检测。将包装好的慢病毒分别转染b.End3,嘌呤霉素筛选稳转细胞系,通过荧光显微镜、RT-qPCR检测对应目的基因表达量,构建稳转细胞系。结果成功构建有效干扰S100A10、MMP-9表达的稳转细胞系,其滴度分别为1×10~8 TU/mL、3×10~8 TU/mL。荧光显微镜检测稳转细胞的荧光表达接近100%;RT-qPCR分别检测MMP9、S100A10基因表达下调率分别为78%、72%。结论构建有效干扰S100A10、MMP-9表达的稳转细胞系,为控制单一变量直观探究S100A10、MMP-9影响隐球菌穿过血脑屏障的能力等研究奠定了重要基础,为隐球菌性脑炎/脑膜炎的临床治疗靶点研究开辟新的思路。     

大熊猫生长分化因子9(GDF-9)基因克隆与序列分析

生长分化因子9(GDF-9)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一个新成员,主要表达于卵母细胞,调节卵泡早期发育. 本文以大熊猫基因组DNA为模板,克隆了大熊猫GDF-9基因.序列分析显示:大熊猫GDF-9基因含两个外显子,编码一个由453个氨基酸组成的蛋白前体.该结果为进一步分析大熊猫GDF-9基因生物学功能奠定了基础.     

S100A8、S100A9在幽门螺杆菌相关胃癌 发生发展中的作用研究进展

S100家族是由20余个结构相似但功能各异的成员组成。该家族成员广泛参与感染、促炎、自身免疫等各种病理过程。近年来,越来越多学者发现S100家族成员在肿瘤的发展过程中也有不同程度的表达失调,且具有特异性。胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一,国家癌症中心统计数据表明,2015年我国胃癌新发病率为679/10万,死亡率为498/10万[1],位居所有恶性肿瘤第2位。幽门螺杆菌(H.pylori)作为胃癌的Ⅰ类危险因子,目前其与胃癌的密切关系也得到了广大学者的认可。研究发现,S100家族成员——S100A8、S100A9在H.pylori感染相关胃炎、胃癌患者病理组织中表达显著上调,因此其在胃癌发生发展中的作用受到了学者的关注。本文主要就S100A8、S100A9在H.pylori相关胃癌发生发展中的作用作一综述。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN 基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制

基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease）基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN（tudor staphylococcal nuclease）基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN 基因第2个外显子的上下游sgRNA（single-guided RNA）,构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2 细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western 印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8（cell counting kit 8）实验进行细胞周期和增殖的检测。Western 印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN 蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除（KO）细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2 野生型（WT）细胞的54.28%±0.21% 升高到KO细胞的61.96%±0.40%（*P< 0.05）。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6 d的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19（*P< 0.05）。本实验成功构建了H9c2 细胞Tudor-SN 基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN 基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。     

大黄鱼ubc9基因的克隆和组织表达

类泛素化(sumoylation)是一种重要的转录后修饰过程.激活的SUMO(small ubiquitin-related modifer)和E2结合酶结合稳定后共价结合到底物上,从而完成对底物的类泛素化.UBC9(ubiquitin-conjugating enzyme)作为惟一的E2结合酶,在完成类泛素化中起着重要作用.从已构建的大黄鱼性腺线性化cDNA文库中筛选出ubc9同源片段,用SMART-RACE方法克隆得到了846 bp的全长cDNA序列.该序列编码一个由158个氨基酸组成的蛋白.该蛋白序列与已知的UBC9高度同源,含UBC保守结构域和UBC9激活位点区域.实时定量PCR分析ubc9基因在各组织器官的表达,结果发现,ubc9基因在大黄鱼的性腺中大量表达.推测UBC9在大黄鱼性腺发育中起重要的生物学作用.     

3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备

9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD)是制备甾体类药物的重要中间产物。3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)能够转化雄烯二酮(AD)产生9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),该酶由Ksh A和Ksh B两个亚基构成。为获得高效积累9-OH-AD的重组菌株,本研究选择耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc2155和戈登氏菌Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395,对其在胆固醇为唯一碳源条件下表达明显上调的ksh A和ksh B候选基因进行克隆,插入到分枝杆菌表达载体p NIT中,构建共表达质粒,并将它们导入分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805中,获得重组菌株。利用重组菌株分别对植物甾醇、胆固醇和谷甾醇进行生物转化,分离纯化转化产物,采用光谱学方法鉴定其化学结构,确定该转化产物为9α-羟基雄烯二酮,说明分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805由积累雄烯二酮变为积累9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),进而证明导入的候选基因ksh A和ksh B确实为有功能的基因。生物转化实验表明,与胆固醇、谷甾醇相比,植物甾醇作为底物更易于转化;而用来源于耻垢分枝杆菌的ksh A、ksh B构建的重组菌转化率更高,可达90%,具有较高的应用价值。本研究通过对KSH编码基因的异源表达,成功地进行了分枝杆菌生物转化特性的改造,为探索各种甾体药物中间体的工业生产奠定了基础。     

快速构建CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统

CRISPR/Cas9核酸酶作为一种新的基因组靶向编辑技术,已成功应用于多种动植物基因组修饰研究. CRISPR/Cas9作用后的阳性细胞筛选和富集是该技术的关键之一. 本研究以鸡EAV-HP（endogenous avian retrovirus-HP）基因和MSTN（myostatin）基因为例,从靶位点的选择、表达载体构建、双基因报告载体构建和核酸酶活性验证4个方面,系统研究了CRISPR/Cas9核酸酶技术平台. 结果表明,利用寡聚核苷酸直接退火方法,构建表达载体和报告载体的阳性率分别高达100%和89.5%. 报告载体的PuroR（puromycin resistant gene）和eGFP（enhanced green fluorescent protein）基因的成功表达表明,构建的CRISPR/Cas9系统能有效切割靶序列,并用于后续阳性克隆的筛选和富集. 本方法摒弃了传统分子克隆的PCR扩增和酶切处理目标基因的方法,而是利用寡聚核苷酸直接退火获得含有黏性末端的目标DNA,简化了载体构建过程,低成本且快速获得CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统.