紫云英根瘤菌菌株107exo基因簇的遗传互补分析

紫云英根瘤菌菌株１０７经Ｔｎ５插入诱变,得到１２株胞外多糖缺陷型变种,以质粒ｐＭＮ２为载体,从其中７株ＥＰＳ＾－变种内分别构建了７个Ｒ－ｐｒｉｍｅ质粒（ｅｘｏＲ）大部分变种的ＥＰＳ＾－表型可被ｅｘｏＰ互补,恢复野生型表型（ＥＰＳ＾＋）。互补表明,１２株ＥＰＳ＾－变种可分为６个不同的互补群,其中５个在遗传上连锁,ｅｘｏＰ酶切分析,除ｅｘｏＲ－０２,ｅｘｏＲ－０４外,其余５只的外源片段均整合于ｐＭＮ２     

紫云英根瘤菌107菌株exo基因簇非连锁突变位点的克隆

用鸟枪法从３株紫云英根瘤菌１０７菌株的胞外多糖合成缺陷变种ＮＡ－０５、ＮＡ－０７和ＮＡ－０８中克隆获得含有１０７菌株ｅｘｏ基因及Ｔｎ５的ｅｘｏ：Ｔｎ５片段。以ｐＲＫ４１５为载体构建１０７菌株ＥｃｏＲＩ酶切后ＤＮＡ片段的部分库,用ｅｘｏ：Ｔｎ５做探针原位杂交得到一个阳性克隆。该克隆的外源片段４．２ｋｂ能恢复３个变种的多糖表型及结瘤固氮能力。酶切分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,３株变种中Ｔｎ５插入位点     

紫云英根瘤菌107菌株exo基因簇非连锁突变位点的克隆

用鸟枪法从3株紫云英根瘤菌107菌株的胞外多糖合成缺陷变种（Exo-）NA－05、NA－07和NA－08中克隆获得含有107菌株exo基因及Tn5的exo::Tn5片段。以pRK415为载体构建107菌株EcoRI酶切后DNA片段的部分基因库,用exo::Tn5做探针原位杂交得到一个阳性克隆。该克隆的外源片段4．2kb能恢复3个变种的多糖表型及结瘤固氮能力。酶切分析和Southern杂交表明,3株变种中Tn5插入位点相近。     

影响紫云英根瘤菌入侵和根瘤发育的exo基因的克隆及分析

紫云英根瘤菌菌株１０７的３个胞外多糖缺陷突变株ＮＡ－０１、０２、０４不具备诱导宿主植物紫云英结瘤的能力。以ＮＡ－０１突变位点的ＤＮＡ面为探针,从可互补这３个变种的ｅｘｏＲ’－１１质粒上亚克隆到２．６ｋｂ的ＤＮＡ片段。互补试验表明,２．６ｋｂ的片段不仅可纠正突变株的胞外多糖缺陷表型,而且使变种恢复诱导宿主植物形成有效根瘤的能力,２．６ｋｂ片段经Ｔｎ５定位突变后丧失这种恢复能力,表明该片段带有对应于３     

影响紫云英根瘤菌入侵和根瘤发育的exo基因的克隆及分析

紫云英根瘤菌菌株107的3个胞外多糖缺陷突变株NA－01、02、04不具备诱导宿主植物紫云英结瘤的能力。以NA-01突变位点的DNA片段为探针,从可互补这3个变种的exoR′－11质粒上亚克隆到2．6kb的DNA片段。互补试验表明,2．6kb的片段不仅可纠正突变株的胞外多糖缺陷表型,而且使变种恢复诱导宿主植物形成有效根瘤的能力。2．6kb片段经Tn5定位突变后丧失这种恢复能力,表明该片段带有对应于3个变种的野生型基因。     

紫云英根瘤菌107菌株酸性胞外多糖的分离纯化及结构分析

用化学沉淀法和柱层析法,分离纯化了紫云英根瘤菌野生型１０７菌株,胞外多糖合成缺陷型变种ＮＡ０２及其回复子ＮＡ０２（Ｒ‘－１１）产生的酸性胞外多糖（ＥＰＳ）。结构组成分析表明：菌株１０７与ＮＡ０２（Ｒ’－１１）产生的ＥＰＳ糖组分均由葡萄糖、半乳糖、核糖和葡萄糖醛酸构成,而变种ＮＡ０２产生的ＥＰＳ只含葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸,与野生型显著不同。３个菌株的ＥＰＳ均有乙酰基取代,而无其它形式的取代基。Ｅ     

紫云英根瘤菌107菌株酸性胞外多糖的分离纯化及结构分析

用化学沉淀法和柱层析法,分高纯化了紫云英根瘤菌野生型107菌株、胞外多糖合成缺陷型变种NA02及其回复子NA02（R'－11）产生的酸性胞外多糖（EPS）。结构组成分析表明：菌株107与NA02（R＇－11）产生的EPS糖组分均由葡萄糖、半乳糖、核糖和葡萄糖醛酸构成;而变种NA02产生的EPS只含葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸,与野生型显著不同。3个菌株的EPS均有乙酰基取代,而无其它形式的取代基。EPS的酸性来自葡萄糖醛酸。1H－NMR分析表明,野生型菌株107和回复子NA02（R＇－11）的EPS糖残基通过α和β糖苷键方式连接,而变种NA02EPS的糖链中均为α连接方式。     

紫云英根瘤菌胞外多糖合成基因exo1的序列分析

对互补紫云英根瘤菌Ｅｘｏ－Ｎｄｖ－Ｆｉｘ－变种的２．６ｋｂＤＮＡ片段进行序列测定。分析结果表明,该片段内存在一个完整的阅读框架（ＯＲＦ）ｅｘｏ１。ｅｘｏ１编码３４０个氨基酸,为细胞质蛋白。Ｅｘｏ１蛋白序列与苜蓿根瘤菌的糖基转移酶ＥｘｏＵ有较强的同源性。利用启动子检测质粒,分析ｅｘｏ１基因的表达,发现在ｅｘｏ１基因上有两个启动子活性区段,Ｐｅｘｏ１ａ位于基因前端,Ｐｅｘｏ１ｂ位于基因中间。Ｐｅｘｏ１ａ很可能包含了ｅｘｏ１基因的启动子。     

紫云英根瘤菌的exo与nod基因在宿主结瘤过程中的协同作用

紫云英根瘤菌菌株107经转座子Tn5诱变的胞外多糖合成缺陷型变种(Exo~-),在共生性状方面的改变有四种类型。我们选用了仅在宿主根部形成瘤状突起(Calli)的A类(NA-01,NA-02)、形成无效瘤(Nod~ ,Fix~-)的B类(NA-12)及不结瘤的(Nod~-)D类(NA-14)中的四个突变株分别与消除了共生质粒的Exo~ Nod~-变种(热处理变种及ANU-1116)混合接种紫云英幼苗,观察到与D类变种配合的接种组仍不能结瘤,而与A,B两类变种配合的接种组均诱导宿主产生形态正常的无效根瘤,并且该无效瘤全部被Nod~-变种侵占。说明一个表型仍为Exo~ ,但失去共生质粒的Nod~-变种,可在一个含有该质粒的Exo~-变种的帮助下进入根瘤。这提示共生质粒上的结瘤基因(nod)仅与侵染过程的早期有关,瘤的发育尚需根瘤菌的其他基因,其中包括exo基因的参与。 此外,共生质粒缺失的三个异种根瘤菌突变株分别与紫云英根瘤菌Exo~-变种混合接种时,也都在紫云英根部诱导出无效瘤,并且从瘤中能分离到这三个异种菌。表明在最初的识别作用发生后,植物对共生菌的专一性要求有所降低。     

紫云英根瘤菌109菌株吸氢特性及碳底物的调节

紫云英根瘤菌109菌株完整细胞的吸氧活性,在空气气相中衰减快,加氢或降低温度,衰减延缓。完整细胞的吸氢反应受体,包括甲基蓝、氧、铁氰化钾、TTC、甲基紫精、Cyt C_3、硝酸钾、DCPIP和反丁烯二酸盐的表现不相同。当氧为受体时,气相氧浓度为5％,吸氢值最大,甲基蓝为受体时,吸氢活性高。另外,氧为受体的吸氢受到碳水化合物抑制,并与基础吸氧速率相关。紫云英根瘤菌的氢氧化与碳水化合物氧化竞争电子传递途径。     

紫云英根瘤菌109菌株的氢氧化电子传递链

H_2还原减去O_2氧化的差示光谱显示424,522,552,560,603nm峰,鱼腾酮(反竞争性抑制),DBMIB,HQNO,抗霉素A,氰化钠和叠氮化钠(非竞争性抑制)明显抑制吸氢活性,表明细胞色素c,b和a分别参与氢氧化的电子传递。以Dixon作图来确定抑制剂在电子传递链中结合位点数目,鱼腾酮和DBMIB为单位点结合,HQNO和氰化物为双位点结合,HQNO所引起的部份抑制,可使对氰化钠敏感的结合位点消逝。鱼腾酮与HQNO同时存在时,其叠加或累积抑制效果表明,两种类型的细胞色素b参与氢氧化的电子传递,由H_2到O_2的电子传递于细胞色素b处分叉,对氰化物抑制敏感性也有所不同。     

紫云英根瘤菌及巴西固氮螺菌的氢酶表达特征

紫云英根瘤菌氢酶表达依赖于H_2并受碳底物和高O_2浓度的阻遏及cAMP的显著促进。整体细胞的吸氢活性对O_2不敏感,受碘乙酸(50mmol L~(-1))的强烈抑制。少数氧化还原电位为正值的人工电子受体可支持吸氢活性。与紫云英根瘤菌不同,巴西固氮螺菌氢酶表达并不依赖于H_2,受碳底物阻遏及cAMP促进的效应均不显著,而对O_2敏感。整体细胞吸氢活性受碘乙酸的抑制作用不明显。无论正、负值氧化还原电位人工电子受体均可支持吸氢活性。在经饥饿的静止细胞中,H_2可支持固氮活性并增强固氮酶对O_2的耐受能力。     

紫云英根瘤菌109菌株氢酶的诱导表达——氧呼吸参与调节(英文)

异养生长的紫云英根瘤菌,其吸氢活性的表达在很大程度上取决于耗氧速率。30个诱导系统的统计和回归分析表明:菌体吸氢活性的表达与耗氧速率之间存在有负相关性。添加碳水化合物,可导致吸氢表达的抑制和推迟,同时引起细胞生长量和耗氧速率的增加。但抑制程度与细胞生长量之间并无明显相关性,而往往与耗氧速率增加相关,氢酶表达时间是在耗氧速率降低到较低水平的时刻。向指数期培养物中添加能量解联剂CCCP(carbonyl cyanide—m—chlorophenylhydrazone)和DNP(2,4—dinitrophenol),降低耗氧速率,氨酶表达可去阻抑。试验还表明:马铃薯汁对吸氢表达有明显的促进效果,可解除某些碳水化合物的阻抑,使某些表型为Hup~-的菌株转变为Hup~+。     

紫云英根瘤菌109菌株吸氢的诱导表达——核苷、核苷酸与烟酸的促进效应

核苷酸和烟酸的添加,使紫云英根瘤菌109氢酶吸氢活性表达增加。cAMP(1 mmol/L),烟酸(70 mmol/L)的存在,缓解了葡萄糖酸钠或果糖引起的吸氢活性阻遏,cAMP的解阻遏效应在年轻的菌体(48 h)表现较为明显。但以MB为受体的破碎细胞吸氢活性则未见增加,烟酸的促进效应受到氯霉素(40μg/ml)的抑制。其他核苷或核苷酸,如腺嘌呤,尿嘧啶,ATP,ADP,AMP,UMP,UTP都能促进吸氢活性的表达。诱导氢酶前,细胞ATP库已处于低水平,并保持稳定,添加琥珀酸盐后,ATP库水平提高,吸氢活性表达受抑。     

毛豆根瘤菌转吸氢基因的研究

通过三亲本杂交将携带豌豆根瘤菌吸氢基因的质粒pAL₆₁₈转移到台湾毛豆根瘤菌292-C中,经抗性筛选、质粒检测和吸氢活性测定,得到能稳定遗传的结合株292-C₂和292-C₃。在自生条件下结合株均表现较高的吸氢活性,而受体株292-C不吸氢,在共生条件下结合株表现为高吸氢,而受体株表现为放氢。     

含花生根瘤菌吸氢基因重组质粒pZ-55的特性分析

应用含豌豆根瘤菌部分吸氢基因的探针及PCR分析,从花生根瘤菌基因文库中筛选到含有吸氢基因的重组质粒pZ-55。用BamHⅠ、EcoRⅠ和KpnⅠ等内切酶对pZ-55 进行酶切分析,构建了pZ-55的酶切物理图谱。经三亲本杂交分析,pZ-55能互补诱变株Ln-1（Hup