水稻稻瘟病拮抗菌L1鉴定及抑菌特性的初步研究

本研究对水稻稻瘟病菌的拮抗菌L1形态、生理生化特性等进行测定, 结果发现其为杆状细胞、革兰氏阳性、菌落不规则有褶皱、好氧生长、颜色较深等, 初步鉴定为枯草芽孢杆菌; 拮抗菌L1培养5 d的发酵液抑菌活性最高, 抑菌率为74.57%; 拮抗菌L1对水稻稻瘟病菌的拮抗活性物质对温度不敏感; 拮抗菌L1的发酵液用硫酸铵梯度沉淀法提取粗蛋白, 在50%~60%硫酸铵饱和度下沉淀的粗蛋白质对水稻稻瘟病菌抑菌效果最好, 平均抑菌半径达0.51 cm。     

一株拮抗黄单胞菌的贝莱斯芽孢杆菌的分离和鉴定

【目的】为了筛选防治水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS)的生防细菌。【方法】以水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)的模式菌株RS105为靶标菌,采用平板稀释和抑菌圈法,从空心菜根际土壤中筛选到一株对RS105具有拮抗作用的细菌菌株504。通过形态学、生理生化特征以及16SrDNA和gyrA序列分析对菌株504进行了鉴定。利用牛津杯法测定504对植物病原黄单胞菌的拮抗活性及其无菌发酵液拮抗活性的稳定性。通过PCR扩增预测504编码合成脂肽类和聚酮类化合物的合成相关基因。采用苗期水稻注射接菌法来评价水稻组织中504对Xoc的拮抗活性。【结果】菌株鉴定结果表明504为贝莱斯芽孢杆菌,命名为Bacillusvelezensis504。抑菌实验显示,B.velezensis504对黄单胞菌属的细菌具有较好的抑菌活性,对水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae,Xoo)的拮抗效果最显著。基因预测结果显示,B. velezensis 504含有fenA、dhbA、sfrA、bmyA、beaS、dfnA及bacA等编码脂肽类和聚酮糖类抑菌化合物的基因簇。其无菌发酵液的活性物质耐高温和蛋白酶降解,但不耐强酸、强碱,在pH值为5.5–8.9时仍具有稳定的拮抗活性。在高感水稻品种原丰早上,B. velezensis 504对Xoc在水稻叶片中引起的水渍症状具有显著的抑制作用。【结论】B. velezensis 504能够特异性拮抗黄单胞菌,在黄单胞菌引起的细菌性病害的生物防治中将具有较大的应用潜力。     

枯草芽孢杆菌SN-02发酵液的抑菌谱及稳定性研究

目的:研究枯草芽孢杆菌SN-02发酵液的抑菌谱及稳定性。方法:以28种植物病原菌为供试菌,杯碟法测定SN-02菌发酵液的抑菌谱;以烟草靶斑病菌为指示菌,杯碟法测定发酵液的热稳定性、酸碱稳定性及传代稳定性。结果:SN-02菌发酵液对28种供试菌株的抑菌圈直径在20mm以上。将发酵液于120℃处理2.5h,-20℃处理25d抑菌活性没有明显变化;发酵液在pH 4~9时抑菌活性无明显变化,在pH 1~3和pH 10条件下抑菌活性明显下降;连续培养10代,发酵液抑菌活性没有下降。结论:SN-02菌发酵液抑菌谱较广,耐高温和低温,传代稳定性好,但在强酸和强碱条件下稳定性较差。     

侧孢短芽孢杆菌X10拮抗物质的提取和特性分析

从侧孢短芽孢杆菌X10发酵液中提取的拮抗蛋白粗提液具有抑制茄科劳尔氏菌生长的效果,该抗菌蛋白粗提液具有良好的热稳定性,能耐90℃的高温;用蛋白酶处理,其抑菌活性受胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的影响;对氯仿敏感;随着紫外照射时间的延长,活性受到影响;拮抗物质25℃保存,活性28天内基本不变;作用活性pH值(pH值5.0～11.0)范围较宽.     

枯草芽孢杆菌B-332产抗稻瘟病菌的活性物质分析

枯草芽孢杆菌B-332能够产生具有稻瘟病菌拮抗活性的物质。通过等电点法提取该抗菌液粗提物,并利用高效液相色谱-质联用仪对粗提物进行分离纯化,共得到5个组分,它们的质荷比(m/z)分别为1 045.0、1 057.8、1 072.3、1 017.5和1 031.1,是Bacillomycin D(C14-C17)的同系物(质荷比(m/z)为1 017.5的除外),它们结构间相差1个或几个-CH2-基团;各组分均对稻瘟病菌有抑制作用,其中质荷比(m/z)为1 045.0、1 057.8、1 072.3组分的抑菌效果最强。致畸作用试验表明,这3种组分的致畸作用均为使稻瘟病菌的附着孢膨大破裂,与B-332菌株的致畸作用相同,证实了这3种组分是B-332菌株产生具有抑制稻瘟病菌作用的主要活性成分。     

枯草芽孢杆菌TF26抗菌蛋白抑菌活性的初步研究

目的:研究枯草芽孢杆菌TF26抗菌蛋白的抑菌活性和生物稳定性,为菌株及抗菌蛋白的应用提供理论依据.方法:采用硫酸铵盐析方法提取抗菌蛋白,采用菌丝生长速率法检测其对13种植物病原真菌的抑菌活性,采用抑菌圈方法对其生物稳定性进行分析.结果:抗菌蛋白粗提物能够抑制13种植物病原真菌的生长,平皿抑制率为74.3％ ～91.3％,对葵花菌核病菌、番茄和黄瓜枯萎病菌、黄瓜菌核病菌和立枯病菌、水稻恶苗病菌和大豆根腐病菌抑制作用较强.抗菌蛋白在100℃以下,pH＜ 10范围内抑菌活性稳定,对紫外线照射不敏感,室温(20℃)和4℃储存150d抑菌活性稳定.结论:抗菌蛋白具有较强的热、酸碱、紫外和储存稳定性以及广谱的抑菌活性.     

Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外抑菌脂肽的分离与鉴定

Bacillus amyloliquefaciens C-1为本实验室从即食食品中分离出的菌株,其发酵液上清具有一定的抑菌活性。通过酸沉淀法从发酵液上清中分离粗脂肽,并确定脂肽是发酵液上清中具有抑菌活性的物质。本实验以蜡样芽孢杆菌MS10362R(产黑色素)、蜡样芽孢杆菌CMCC63301(不产黑色素)和大肠杆菌O157∶H7 CDC157为指示生物进行粗脂肽的抑菌活性测定,结果显示0.1 mg/m L的脂肽对这三个菌的6 h生长抑制率分别96%、75%、93%;同时在不同温度、蛋白酶和有机溶剂处理下分别测定了该脂肽的抑菌活性稳定性,结果显示C-1抑菌脂肽对这些处理均不敏感,其抑菌活性非常稳定,具有很好的开发应用潜力。     

贝莱斯芽孢杆菌Bv-303对水稻白叶枯病菌的拮抗活性及其应用

本研究明确了一株新型贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) Bv-303菌株对黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)的拮抗活性及其对水稻白叶枯病(bacterial-blight,BB)的生物防治效果。采用牛津杯法测定了菌株Bv-303发酵上清液(cell-free supernatant, CFS)对白叶枯病菌体外拮抗的活性及其稳定性;通过对接种白叶枯病菌的水稻叶片进行喷雾处理,在水稻体内测试了该菌株发酵液(cell-culture broth,CCB)、发酵上清液及菌悬液(cell-suspension water,CSW)对白叶枯病菌的抑制效果;并统计了该菌株对水稻种子发芽率与幼苗生长的影响。结果表明,在体外,菌株Bv-303发酵上清液对白叶枯病菌的生长抑制率可达85.7%–88.0%,对热、酸、碱、紫外线等具有较好的稳定性;在水稻叶片上,喷施该菌株的发酵液、发酵上清液及菌悬液均能提高植株对白叶枯病的抗性,其中发酵液的效果最佳,抗病性提高率高达62.7%;且发酵液对水稻种子萌发和幼苗生长均没有副作用。因此,菌...     

一株蜂粮源拮抗细菌的分离鉴定及其抑菌物质特性

【目的】为发掘和利用蜂粮中拮抗菌资源,对分离获得的拮抗细菌菌株PC2进行分类鉴定,并测定其发酵液抑菌物质基本特性。【方法】采用改良牛津杯双层平板法测定菌株发酵液抑菌谱及温度、p H、紫外线和蛋白酶对其抑菌活性稳定性的影响,菌株鉴定结合形态学、生理生化特征和16S r RNA基因序列分析,硫酸铵沉淀法和盐酸沉淀有机溶剂提取法进行抑菌活性物质的初步分离。【结果】从3种蜂粮中分离筛选得到17株拮抗菌株,其中1株细菌PC2以马铃薯葡萄糖液体培养基发酵制备的无菌发酵液对7种供试菌株具有较强抑制作用,经形态、生理生化特征及16S r RNA基因序列分析,将其初步鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株发酵液抑菌活性对温度、酸和紫外线具有较强的稳定性,对蛋白酶K、胃蛋白酶、碱性蛋白酶处理敏感。菌株发酵液存在抑菌蛋白和脂肽类物质。【结论】菌株PC2在食品保鲜和农业生防中具有潜在的开发应用价值。     

一株水稻根内生拮抗细菌SM13的分离及鉴定

【背景】作物根内生细菌具有固氮、分泌激素、产生病原真菌抗性物质等特性,根系内生菌的分离及应用成为环境友好型防控技术研究的热点之一。近年来盐碱地水稻种植面积逐年增加,而关于盐碱地水稻根内生菌的分离与应用鲜有报道。【目的】从大庆盐碱地水稻根中分离内生细菌,筛选对植物真菌病害有拮抗作用的促生菌株,初步探讨其抑菌和促生功效,为进一步研究其抑菌和促生机理提供菌种资源。【方法】对水稻根表面灭菌后研磨涂布分离内生细菌,采用对峙培养法和改良Salkowski比色法筛选具有广谱抑菌效果并有分泌吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)能力的菌株,通过形态鉴定、革兰氏染色、生理生化测定、16S rRNA结构基因以及srfA、ituA、fenB功能基因序列系统进化分析,确定细菌的分类地位。【结果】从水稻根部分离到一株内生细菌SM13,该菌株具有广谱性抑菌作用,对玉米新月弯孢菌、大豆菌核病菌、稻瘟病菌、禾谷镰刀菌的抑菌率分别为59.38%、78.13%、53.12%、37.50%,分泌IAA的能力为5.56±0.41μg/mL (n=6)。经形态学、生理生化试验结合系统进化分析初步鉴定SM13菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌株在pH 11.0、盐浓度10%的NA培养基中生长良好,具有较高的耐盐碱性。【结论】水稻根内生菌SM13菌株具有耐盐碱性、促生和生防性能,可作为微生物农药及菌肥的材料。     

南极沉积物来源抗菌细菌的筛选及抑菌物质的鉴定

【背景】科学研究表明,由于南极环境条件特殊,微生物资源丰富,有望筛选出功效显著的抗菌微生物。【目的】以黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)为指示菌,从南极沉积物中分离筛选具有拮抗作用的细菌菌株并对其抑菌物质进行初步鉴定。【方法】应用平板对峙法和琼脂扩散法分别对样品和发酵液进行初筛和复筛,筛选出对F. equiseti抑菌效果最强的菌株,基于形态学、生理生化、分子生物学分析,对该菌株进行鉴定。之后,对目标菌株发酵上清中的抑菌物质进行抑菌谱研究,并对其抑菌成分进行温度和pH的稳定性检测,通过硫酸铵沉淀的方法初步鉴定发酵液中的抑菌物质。【结果】从南极沉积物样品中共分离纯化出62株细菌,有5株具有较好的抑菌效果,其中抑菌效果最强的菌株鉴定为枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii),命名为JYM35。抑菌谱检测结果显示,菌株JYM35对丝瓜枯萎病致病菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)和辣椒枯萎病致病菌F. equiseti具有较强的抑菌效果,对长豆褐腐病致病菌笄霉属(Choanephora)有较明显的拮抗作用,对水产致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)也有一定的拮抗作用。菌株JYM35发酵上清中所含的抑菌物质热稳定性强且耐碱不耐酸,硫酸铵沉淀后可初步确定其抑菌物质隶属蛋白类。【结论】菌株JYM35是一株产蛋白类活性物质的广谱型抑菌菌株,对枯萎病致病菌的拮抗作用最强。因此具有较好的开发利用价值。     

Isolation, partial purification and characterization of a bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus subtilis strain

A wild type micro-organism producing antibacterial substances has been isolated from a Chinese fermented soybean seasoning and identified as Bacillus subtilis. A crude antibacterial preparation (CABP) was obtained by ammonium sulphate precipitation. Isoelectric focusing assay revealed at least four antimicrobial components in the CABP. However, in SDS-PAGE analysis, only one peptide band displayed antimicrobial activity against pathogenic Bacillus cereus and Listeria monocytogenes. This inhibitory peptide had a molecular weight of approximately 3.4 kDa and a pI value of approximately 4.7. Results of this study suggest that at least one antimicrobial substance produced by this wild type strain of B. subtilis may be a new bacteriocin. Its sensitivity to gastric peptidases and activity against the food-borne pathogens make this bacteriocin potentially useful as an antimicrobial agent in foods.     

具有群体感应抑制效果芽孢杆菌的筛选与鉴定

细菌性疾病是危害水产业健康发展的主要原因之一,从抑制调控致病菌毒力表达的群体感应（Quorum sensing,QS）入手是水产动物疾病防治研究新的热点方向。研究以紫色杆菌 （Chromobacterium violaceum）为报告菌株,采用T型划线和滤纸片法,对分离自异育银鲫肠道及实验室保存的芽孢杆菌F3-1、F3-2、F6-4、F6-5、X77、X93、X3914进行分析测测试,筛选具有群体感应抑制效果的菌株。T型划线结果显示菌株F3-1能够抑制紫色杆菌紫色菌素的产生;滤纸片法结果显示抑制紫色杆菌紫色菌素产生的主要物质存在于菌株F3-1的胞外产物中。试验提取了菌株F3-1的培养物的粗提物,测定粗提物浓度分别在0、50、100、200、300 mg/L时紫色杆菌菌素在585 nm处的光密度值,结果显示随着粗提物浓度的增加其色素的产量显著降低（P0.05）,当粗提物浓度超过200 mg/L时,试管中观察不到紫色菌素存在;利用硫酸铵盐析的方法,提取了菌株F3-1的粗提物中蛋白产物,滤纸片扩散法结果显示表明其胞外蛋白是紫色杆菌QS系统的抑制物质。通过分子生物学16S rDNA鉴定,确定菌株F3-1为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus,GenBank accession No. JX984444）。电镜照片显示该菌具有短杆状特征,因此,分离自异育银鲫肠道的短小芽孢杆菌F3-1具有抑制细菌群体感应的作用。       

骆驼蓬(Peganum harmala)蛋白质的分布、提取及活性研究

采用不同溶剂分级提取骆驼蓬（Peganum harmala L．）根、茎、叶及种子中的蛋白质,结果表明总蛋白以种子中的蛋白含量最高,而营养器官以叶中的蛋白含量较高。当年种子总蛋白含量显著高于贮藏种子。不同溶剂分级提取的当年生种子、根、茎和叶中各组分,以碱提组分蛋白含量最高。用含不同盐离子浓度的缓冲液和不同pH值的广泛缓冲液提取骆驼蓬种子的蛋白质,结果表明优化后的缓冲液条件为含0．2mol／LNaCl,pH：7．0～8．0的5mmol／LPBS缓冲液。硫酸铵沉淀法获得的骆驼蓬种子中的蛋白粗提物（1．2mg／mL）对供试真菌交格链孢菌（Alternaria alternata）、指状青霉菌（Penicillium degitatum）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和意大利青霉菌（Penicillium italicum）等5种植物病原真菌均有抑菌作用,其中对意大利青霉菌和交格链孢菌表现出较好的抑菌活性,抑菌环直径分别为19．50和18．50mm。对供试细菌表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、臭鼻克雷伯菌（Klebsiella penumoniae）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureua）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）等6种病原细菌也有抑菌作用,其中对臭鼻克雷伯菌、福氏志贺氏菌、表皮葡萄球菌等病原细菌等有较好的抑制作用,抑菌圈直径分别10．20、10．10和9．30mm。     

环状芽孢杆菌几丁质酶基因序列分析、表达和生物活性测定

真菌病害一直是影响作物的主要病害之一 ,每年造成巨大经济损失。几丁质酶可水解许多病原真菌细胞壁所含有的主要成分—几丁质 ,是研究得最多的抗真菌蛋白质。许多几丁质酶基因已从微生物中克隆到 ,芽孢杆菌是一类重要的几丁质酶产生菌。环状芽孢杆菌可产生并分泌多种多糖降解酶类 ,包括几丁质酶、β 1 ,3 葡聚糖酶、β 1 ,6葡聚糖酶和半纤维素酶[1] 。Ｗａｔａｎａｂｅ克隆了环状芽孢杆菌ＷＬ 1 2菌株的几丁质酶基因ｃｈｉＡ和ｃｈｉＤ ,对该几丁质酶基因的结构和功能进行了深入研究[2～ 4 ] 。我国的陈三凤克隆了黄杆菌的几丁质酶基因 ,…     

Mucoromycotina sp. HS-3对苯胺蓝染料的降解

采用静置开敞式培养法研究了碳源、氮源、盐度、金属离子对Mucoromycotina sp.HS-3菌降解苯胺蓝的影响。结果表明,菌株脱色最适合条件为葡萄糖1 g/L,硫酸铵0.6 g/L,Fe3+0.15 mmol/L,盐度小于50 g/L,在上述各培养条件下,对浓度为100 mg/L不灭菌的苯胺蓝溶液静止培养5 d,脱色率达95%以上。此外,通过降解前后的苯胺蓝溶液对豇豆和枯草芽孢杆菌进行毒性测试发现,降解后的苯胺蓝溶液毒性明显降低。因此,该菌对处理以苯胺蓝为主要成分的印染废水具有较好的应用潜力。     

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%。酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5.0,该酶在pH3.4-6.0下稳定,高温耐受性差。Cu2+、Zn2+、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca2+和Mn2+对酶具有较强的激活作用。     

A simplified procedure for the analysis of DNA polymerase III levels in Bacillus subtilis strains.

A simple and reproducible procedure is described which allows the fast and almost quantitative removal of DNA polymerases I and II from DNA polymerase III, in crude extracts of polA+ strains of Bacillus subtilis. The procedure entails streptomycin sulfate and ammonium sulfate fractionations; subsequent analysis of the partially purified preparation by G-200 chromatography, DEAE cellulose chromatography and density gradient sedimentation, shows that the ammonium sulfate fraction contains less than 5% of the total activity as DNA polymerase I and less than 2% as DNA polymerase II. The purification procedure, up to the ammonium sulfate step, was utilized for the analysis of the level of DNA polymerase III in several B. subtilis mutants, with results comparable to those obtained from the corresponding polA- strains following more cumbersome purification procedures. The M.W. of the purified form is of 227.000, somewhat greater than the published values. The early fractions of the purification have revealed the existence of a form with a M.W. of 426.000; the nature of this form, which has been observed in several instances and which is very unstable and short-lived, is under investigation.