通过接合作用质粒从大肠杆菌到棒状杆菌的转移

构建了可接合转移的穿梭质粒pXZ911、pBZ51和pBZ52。这些质粒中含有具转移功能的Mob片段和在棒状杆菌中复制的复制区。以大肠杆菌S17—1为供体菌,通过接合转移作用,可将这些质粒转移到谷氨酸棒杆菌ATCCl3032、谷氨酸棒杆菌ATCC21543、北京棒杆菌B3、北京棒杆菌1．299、裂氏棒杆菌B43、黄色短杆菌ATCC 14067等棒状杆菌苗株,接合转移频率分别为：9X10^-5,1X10^-4,8．5x10,2．3X10^-4×10^-5,2．9X10^-5。本文还探索了大肠杆菌和几种革兰氏阳性棒状杆菌问基因转移的方法、转移频率、影响转移频率的因素、宿主范围等问题。     

侧孢芽孢杆菌质粒提取方法的探究

以能够降解有机磷农药的两株侧孢芽孢杆菌BL-21和BL-22为研究对象,分别采用碱裂解法、试剂盒提取法和SDS法对侧孢芽孢杆菌BL-21和BL-22的质粒进行提取,并通过凝胶电泳和紫外分光光度法对提取结果进行分析,试验结果证明,适合侧孢芽孢杆菌BL-21和BL-22的质粒提取方法是SDS裂解法,该方法提取的质粒大小为10kb,且该方法提取的结果稳定,质粒的产量和质量均符合分子生物学实验的要求。     

几类快生型根瘤菌质粒的研究

用一种重现性好而较简便的方法,对国内的紫云英、豌豆、三叶草、大豆等快生型根瘤菌及根癌农杆菌共40多号菌进行了质粒分离,所得质粒图谱具有一定的菌株特异性。每株菌有1—3个质粒,其中至少有一个大质粒或巨大质粒。用质粒消除法获得失去结瘤(或致癌)能力的变异株,均缺少一个大质粒。快生型根瘤菌的结瘤基因定位在大质粒或巨大质粒上。用接合法将Rpl：：Tn501等质粒转入根瘤菌中,能诱动根瘤菌的结瘤基因转移给失去结瘤能力的变异株,可表达功能,质粒图谱也发生变化,与供体或受体都不同。     

双歧杆菌质粒的检测及其对抗生素敏感性

本文应用ＬｅＢＬａｎｃ法提取６种２０株双歧杆菌菌株的质粒,发现共有４个种的６株菌株存在着１～３个质粒,多数质粒的分子量小于６．０ｋｂ。存在质粒的双歧杆菌包括分离自人的短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双岐杆菌和婴儿双歧杆菌。用固体培养基滤纸片抑菌圈法测定双歧杆菌对１５种常用抗生素的敏感性,结果表明,测试的２０株双歧杆菌菌株对所检测的１５种抗生素的敏感性无规律可循,而且质粒消除实验表明质粒的存在与所检测的抗生素抗性无相关性。     

氧化硫硫杆菌质粒的分离

用碱法对分离到的7株氧化硫硫杆菌进行质粒检测,在6株中分离到了18个质粒,质粒DNA的分子量为1.3×10~4-98×10~6。     

盐生盐杆菌的质粒及其物理图谱

本文用４种不同的方法对１０株盐生盐杆菌是否含有质粒进行了检测,其中６株含有质粒,均属大质粒。几种检测方法中,以ＴＥＮＳ法效果好。Ｊ７菌株含有１种ＣＣＣ结构十分稳定的质粒,称之为ＰＨＨ２０５,其分子量较小,约为１６．７ｋｂ;拷贝数较高,为４９个／每个细胞。该粒在宿主的对数生长后期出现拷贝数高峰。通过限制性酶切分析,确定了５种酶在ＰＨＨ２０５上的切点,其中ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ和ＸｂａＩ３种酶为单     

VITEK-2 Compact 仪器法鉴定棒状杆菌属细菌的方法学评价

【摘 要】 目的 评价全自动微生物鉴定系统鉴定棒状杆菌属细菌的准确率及可靠性。方法 分别选用VITEK-2 Compact系统、API CORY系统、Vitek-32系统鉴定37株纹带棒状杆菌，5株无枝菌酸棒状杆菌，两种方法间的比较采用卡方检验，同时以“API CORY系统”为金标准，计算VITEK-2 Compact仪器法的特异性、敏感性。结果 经卡方检验，VITEK-2 Compact系统在鉴定纹带棒状杆菌方面具有很好的一致性，特异性为100%，敏感性为100%，kappa值为1.0；VITEK-2 Compact系统在鉴定无枝菌酸棒状杆菌方面一致性较差，kappa值为0。API鉴定为纹带棒状杆菌的37株菌，VITEK-32均错误的鉴定为干燥棒状杆菌，5株无枝菌酸棒状杆菌在Vitek-32鉴定系统中，生长不良。结论 VITEK-2 compact在鉴定纹带棒状杆菌方面较准确可靠，但在鉴定其他棒状杆菌方面还需进一步研究。Vitek-32系统不能准确的鉴定棒状杆菌属细菌。     

八种热带,亚热带豆科植物根瘤菌内源质粒的分布情况

从８种热带、亚热带豆科植物中分离出９种快生型根瘤菌，用双梳子胶内裂解法检测其中的质粒分布情况。质粒数从１到６个不等，大小从３２ｋｂ到８７０ｋｂ，其中至少有一个分子量小于１００ｋｂ的质粒。从不同种属的豆科植物中分离出的根瘤菌，其质粒的数量及分子量各不相同。     

八种热带、亚热带豆科植物根瘤菌内源质粒的分布情况

从８种热带、亚热带豆科植物中分离出９种快生型根瘤菌,用双梳子胶内裂解法检测其中的质粒分布情况。质粒数从１到６个不等,大小从３２ｋｂ到８７０ｋｂ,其中至少有一个分子量小于１００ｋｂ的质粒。从不同种属的豆科植物中分离出的根瘤菌,其质粒的数量及分子量各不相同。     

一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法

目的：建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。方法：用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原生质体,然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒。结果：与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比,用该法获取的酵母质粒在PCR分析及转化效果方面没有差异。结论：建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。     

苏云金芽孢杆菌质粒的检测及功能的初步研究

用改进的酶碱综合法检测了苏云金芽孢杆菌4个亚种11个野生菌株的内生质粒,获得良好的制备结果和重视性,对野生菌株YBT－1463及其无质粒突变株BMB171的形态和生理生化特性的比较研究结果表明,YBT－1463的内生质粒携带杀虫晶体蛋白基因,但不携带抗生素的抗性基因,且与该菌株对19种C源和12种N源的利用无关。     

杭州地区发酵乳制品中乳酸菌发生耐药传播的安全性研究

目的对杭州地区市售发酵乳制品中分离鉴定的乳酸菌进行耐药传播的安全性分析,旨在揭示发酵乳制品中是否存在可传递耐药基因的超级耐药菌。方法自行分离鉴定的耐药乳酸菌,提取质粒并电泳分析是否存在质粒;以耐受叠氮化钠的大肠埃希菌J53作为受体菌进行质粒接合试验;若乳酸菌存在耐药现象,发现存在耐药质粒,且耐药性可通过质粒传播,评定为3级。乳酸菌存在耐药现象,发现存在耐药质粒,但接合试验未能证明耐药性可通过质粒传播,评定为2级。乳酸菌存在耐药现象,但未检测出耐药质粒,评定为1级。结果美丽健产品中分离的双歧杆菌（MLJ-G-2）和乳杆菌（MLJ-G-1）检测出含有质粒,但不会发生耐药转移,三种菌耐药危害等级分别为2、2、1。伊利产品中分离的双歧杆菌（YL-G-3）、乳杆菌（YL-G-1）、嗜热链球菌（YL-Q）检测出含有质粒,但不会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、2、1、2。味全产品中分离的双歧杆菌（WQ-G-3）、乳杆菌（WQ-G-1）、乳杆菌（WQ-G-2）、嗜热链球菌（WQ-Q）均检测出含有质粒,其中乳杆菌（WQ-G-1）、乳杆菌（WQ-G-2）会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、3、3、2。光明产品中分离的乳杆菌（GM-G-2）、乳杆菌（GM-G-3）、嗜热链球菌（GMQ）检测出含有质粒,乳杆菌（GM-G-2）会发生耐药转移,四种菌耐药危害等级分别为2、1、3、2。蒙牛产品中只分离的嗜热链球菌（MN-Q）检测出含有质粒,不会发生耐药转移,耐药危害等级为2。结论发酵乳制品中分离所得的乳酸菌81.2%的菌能检测出质粒,耐药性可能与质粒相关,存在潜在的生物安全威胁;18.8%的菌的耐药性可通过质粒接合发生传播,存在直接的生物安全威胁。     

棒状杆菌启动功能片段的克隆和顺序测定

利用大肠杆菌(Escherichia Coli）的白动子探针质粒pGA46-4,从谷氨酸棒状杆菌(Corynebacrerium glutainicum）染色体DNA中筛选启动功能片段,并测定了重组质粒pGA46-4上的一个约0.4kb的启动功能片段的核营酸顺序。利用pGA46-4和棒状杆菌质粒pXZ10145的EcoRI大片段组建了在大肠杆菌和力士棒杆菌(Corvnebacierium herculis）中都能复制的穿梭质粒pXZ10。     

双歧杆菌的耐药性与质粒

目的：研究双歧杆菌的耐药性与质粒的关系。方法 对１７株５种来自微生态制剂的双歧杆菌进行抗生素药敏试验和质粒检测,利用溴化乙锭消除其质粒;比较质粒消除前后耐药性的改变。结果１７株双歧杆菌对氨基糖式类和多肽类抗生素呈强抗性;除１株短型双歧杆菌Ｂ１５７存有２．７Ｋｂ和５．６Ｋｂ两种质粒外,其余菌株均未质粒,消除后持粒的Ｂ１５７株菌对抗生素的敏感性并未改变。结论 此１７株双歧杆菌的耐药性与质粒无直接相关性     

鼠棒状杆菌PCR检测方法的建立及其应用

目的建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并应用于临床样本检测。方法用脑心浸出液培养基复苏、培养鼠棒状杆菌（corynebacteriumkutscheri,C．kutscheri）并提取基因组DNA作模板;根据GenBank中C．kutsche6的16S基因序列设计合成引物,建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并进行敏感性和特异性的评价;人工感染昆明鼠,建立小鼠棒状杆菌感染模型,采集肝脏和肾脏,提取DNA进行检测。结果成功建立了鼠棒状杆菌PCR检测方法,该方法可检测到100个阳性质粒;对小鼠沙门氏菌、肺炎链球菌和巴氏杆菌无交叉反应;全部8个人工感染样本全部检测为阳性。结论建立的鼠棒状杆菌PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可作为鼠棒状杆菌感染的快速检测方法。     

一株携带质粒的人两歧双歧杆菌的分离与鉴定

目的:分离携带天然质粒的人双歧杆菌.方法:用自制的改良型Blb双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离双歧杆菌,对初步质粒检测阳性的单菌落通过糖发酵试验、(G C)mol%测定和16S rDNA序列分析,进行菌株鉴定.结果:筛选到一株携带天然质粒的人双歧杆菌,编号B200304,在1.0%琼脂糖凝胶上,测得质粒的相对分子质量约为22 kb.通过对该菌株的形态学观察和糖发酵试验等生理生化特征研究,证明该菌株为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum);HPLC法测得其(G C)mol%为55.6,16SrDNA序列分析进一步证实该菌株为两歧双歧杆菌.结论:分离得到一株携带天然质粒的人两歧双歧杆菌新菌株.     

棒杆菌质粒pXZ10145复制功能区定位

将棒杆菌质粒pXZ10145或pNAT65的不同酶切片段装入大肠杆菌质粒pACYCl77中构建了pTSK系列重组质粒。转化棒状类细菌的实验结果确定了质粒pXZ10145上复制必需区的位置。质粒pXZ10145复制最小必需区定位在NaeI-NruI的1.2kb片段上,在这个片段上只有一个约940碱基的阅读框架。它编码一个质粒复制因子,以对位作用方式协助那些不能自我复制但复制起始区仍保持完整的pTSK质粒在棒状类细菌中复制。质粒pXZ10145复制起始区在一个NaeI-SalI的0.3kb片段上,位于已确定的复制因子编码框架中。     

一株双歧杆菌质粒聚合酶基因的PCR扩增和鉴定

目的PCR扩增人双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因。方法用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,PCR扩增长双歧杆菌质粒聚合酶(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)基因,对BPP基因检测阳性的PCR产物通过序列分析,进行鉴定。结果人长双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因PCR扩增后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,测得BPP基因的相对分子质量约为1.9 kb。通过BLAST序列比对分析与GenBank中相应基因同源性为96%。结论成功克隆了1株双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因,为构建与双歧杆菌宿主质粒相适应的载体奠定了基础。     

临床分离纹带棒状杆菌喹诺酮类耐药株gyrA和parC基因突变的研究

目的 探讨gyrA 、parC基因的改变与纹带棒状杆菌耐喹诺酮类抗生素的关系.方法 采用微量稀释法测试纹带棒状杆菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星、万古霉素的敏感性.PCR扩增检测gyrA和parC基因喹诺酮类耐药决定区相关片段并测序,在GenBank中进行Blast及BlastX分析并观察氨基酸突变位点,用NcoI酶进行PCR-RFLP.结果 37株纹带棒状杆菌对环丙沙星和左旋氧氟沙星的耐药率为94.6％,30株菌发生双突变(87位Ser突变为phe,91位Asp突变为Ala),5株菌单点突变(87位Ser突变为phe).PCR-RFLP经NcoI酶切后显示,敏感株和耐药株均产生3个条带.结论 纹带棒状杆菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星的耐药率较高,对万古霉素全部敏感.纹带棒状杆菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制主要是gyrA突变引起的,尤以双突变占优势.纹带棒状杆菌不携带parC基因,不编码拓扑异构酶Ⅳ.     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性.结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达.