硝酸还原酶聚丙烯酰胺凝胶电泳活性染色

高等植物的硝酸还原酶除诱导酶(NR,E.C.1.6.6.1.)外,还有以组成酶(constitative enzyme,E.C.1.6.6.2.)的形式存在,分别以还原辅酶Ⅱ(NADPH,C_1NR)及还原辅酶Ⅰ(NADH,C_2NR)为电子供体。为深入研究NR各同工酶的特性,我们以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对NR粗酶液(油菜子叶)进行分离,完善了以甲基紫精(MV)为电子供体的NR同工酶染色法,并在甲(月替)反应原理基础上首次建立了以NAD(P)H为电子供体的NR活性染色系统。     

杂交水稻生长发育过程中硝酸还原酶活性与产量性状的关系

由于硝酸还原酶(NR)在硝酸同化过程中起着重要作用,人们进行了大量的研究工作,对玉米、小麦、大麦的研究结果均表明NR活性与籽粒及籽粒蛋白质产量相关。近年来的研究表明NR活性与作物的耐肥性呈负相关,并认为这是高等植物的一个普遍规律。肖翊华等对11个杂交水稻组合NR活性的研究认为,NR活性作为优势杂种的预测指标具有很大潜力。本文试图通     

ATP对体外硝酸还原酶活力的影响

硝酸还原酶(以下简称 NR)是高等植物氮素代谢的关键酶,对体内其他代谢也有着重要的影响。最近,我们已报道NR活力能促进ATP的形成。本文则研究了ATP对NR活力的影响。由于外源ATP不有直接进入细胞内,难以观察它对体内NR活力的影响,因此只对它对体外NR活力的影响及其机制进行了研究,并把它与ADP、AMP的影响加以比较。     

生菜硝酸还原酶基因的克隆及高氮水平下外源γ-氨基丁酸对其表达和叶片硝酸盐含量的影响

硝酸还原酶(NR)是硝酸盐代谢的关键酶。该研究在成功克隆生菜NR基因的同时,进行了高氮水平下外源γ-氨基丁酸(GABA)对生菜叶片NR基因表达和NO3--N含量的研究。结果表明:(1)生菜NR基因(GenBank登录号为KP122207)序列长1 791bp,编码585个氨基酸残基,蛋白保守结构域含钼辅蛋白超家族、细胞色素b5超家族和FNR超家族;生菜NR基因与菊苣NR基因亲缘关系最近,序列一致性为93%,与烟草、甜菜、黄瓜、大豆等NR序列的一致性均在80%以上。(2)高氮水平下外源2.5mmol/L GABA处理生菜可诱导NR基因上调表达,并显著提高了生菜叶片NR、亚硝酸还原酶(NiR)、谷氨酸脱羧酶(GAD)活性和NH4+-N含量,降低了NO3--N、NO2--N含量;虽然NO3--N含量与NR、GAD、NiR活性、NO2--N、NH4+-N含量均呈显著相关关系,但与NR活性的相关系数最高且达极显著水平。研究认为,高氮水平下外源GABA可通过诱导NR基因上调表达、增强相关酶活性来影响无机氮代谢,从而降低了生菜叶片硝酸盐含量,其中NR在该过程中发挥着至关重要的作用,为生产中GABA的施用及降低叶菜类蔬菜硝酸盐含量提供了理论依据。     

钼和6-BA对缺钼番茄叶片中硝酸还原酶活性恢复的影响

硝酸还原酶(NR)在植物的氮素营养上是一个关键酶,NO_3~-进入植物体内,首先须经过NR的催化作用才能被还原为NO_2~-,然后再经过其他种酶的作用被同化到蛋白质上。所以对NR的研究一直受到重视。 Nicholas和Nason证明NR中含有金属钼(Mo),以后又有不少工作者研究了Mo与NR的关系。肯定指出Mo构成NR的辅基,处于该酶的活性中心。但是NR又     

NMDA受体在焦虑症发病机制的研究进展

伴随社会生活和工作压力的增大,常见精神类疾病焦虑症的发病率逐年攀升。焦虑症的发病机制非常复杂,迄今尚未完全阐明。本文概述了焦虑症发病机制与NMDA受体不同亚型的关系。NMDA受体主要广泛分布于脑、脊髓和周围神经系统。NR1广泛分布于中枢神经,在NR2D亚基敲除小鼠中,NR1和NR2D的相互影响可能参与了焦虑样行为。NR2A与NR2B是NMDA受体的两个重要亚基,NR2B的高选择性拮抗剂艾芬地尔在小鼠的高架十字迷宫实验中发挥了抗焦虑功效。将小鼠全脑的NR2C基因用NR2B替代之后,1月龄变异小鼠的高架十字迷宫实验显示有明显的非条件性焦虑行为,表明NR2B和NR2C均可能参与焦虑的发生。因此,深入阐明调控NMDA受体亚基组成的确切作用机制,将有助于探索焦虑症潜在治疗靶点的发现,并针对性地开展新药的研发。     

哺乳动物NMDA受体NR3亚基的比较基因组学研究

目的：通过比较基因组学方法对哺乳动物NR3亚基进行分析,探讨其种间功能及结构差异,并预测其功能。方法：应用人类NR3A和NR3B所编码氨基酸序列作为检索探针,通过TBLASTN检索数据库,并应用生物软件进行进化分析及序列对比。结果：共检索到30个哺乳动物NR3A及NR3B基因,其中28个具有完整CDS。进化树显示相同种属均形成独立分支,与人类相似度越高的物种进化距离越近,氨基酸种间比较显示邻接半胱氨酸序列及loopl结构保守性较好,而富含脯氨酸序列在灵长类和啮齿类存在差异。结论：NR3A亚基在人类和啮齿类可能存在功能差异,应用动物模型进行实验应考虑差异可能带来的影响,此外,可推断哺乳动物间NR3亚基富含半胱氨酸序列及loopl结构产生的生理过程及功能相似。     

硝酸还原酶的研究——Ⅳ.NADH对小麦硝酸还原酶的钝化作用

不同浓度的NADH(0.5～4mM)与硝酸还原酶(NR)在不同温度下(0～20℃)一起预保温,均可看到NADH对NR的钝化作用。KCN也抑制NR活性。NADH和KCN同时存在能强烈地协同钝化NR。连二亚硫酸钠也能与KCN协同钝化NR。这种协同钝化作用可被铁氰化钾逆转。在亲合层析纯化的NR上可看到同样的可逆钝化现象,表明NR的氧化还原状态调节NR的活性。     

硝酸还原酶的研究动态

NR的研究已有30多年的历史。近年来,(1)在NR纯化的基础上对其结构和特性已积累了大量资料;(2)根据用新的生物学技术的研究结果,提出酶的诱导可能是酶的从头合成或者酶前体的活化;(3)从NR的合成与降解、活化与钝化等方面,对体内NR活力的调节作了进一步阐述;(4)利用植物NR突变体,开展了NR基因的结构和表达的研究,并取得—定进展。     

硝酸还原酶的研究——Ⅱ.6-BA和光对小麦硝酸还原酶诱导的影响

黄化麦苗在暗中不能由NO_2~-诱导产生NR,而生长在水中的黄化麦苗经6小时以上的预照光,则可在随后的暗期中由NO_3~-诱导产生高活性的NR。白光、红光和远红光的短暂照光,不能使麦苗获得在暗中由NO_3~-诱导高活性NR的能力。无论在诱导介质或非诱导介质中,这种诱导能力在暗中都逐渐消失。DCMU可部分抑制黄化麦苗NR的光下诱导。预照光后植株的NR暗诱导被砷酸钠抑制。葡萄糖能促进离体黄化叶片在暗中诱导形成高于对照的酶活性。预照光通过光合产物为NR合成提供能量,可能是使麦苗能在暗中诱导NR的原因之一。6-BA可促进麦苗NR诱导。单独6-BA对NR无明显诱导作用,但它可明显促进NO_3~-对酶的诱导。NO_3~-、NO_3~-和6-BA的诱导作用均受环己酰亚胺抑制。6-BA缩短了NR诱导的滞后期,6-BA对NR诱导的促进紧密平行于它对叶绿素积累的促进。而光合作用影响NR的诱导,6-BA缩短NR诱导滞后期可能与6-BA加快叶绿体的发育,促进光合作用之间存在着紧密的联系。     

“硝酸还原酶(NR)与作物耐肥性的相关性研究”第二次学术交流会简讯

这次会议于1985年12月21—24日在安徽省芜湖市举行,31名代表分别来自九个省、市的21个大专院校与科研单位。大会首先宣读了15篇研究报告与专题发言:1.对水稻、小麦、小黑麦、玉米、棉花等不同作物和品种在不同地区的NR活力分析,进一步论证了“作物品种耐肥性与NR活力呈负相关”的规律。2.结合小麦育种进行NR分析,表明“相关性”规律应用的可能性。3.从氮代谢、能量代谢对NR活力的调控阐述了“相关     

NMDA受体与中枢神经系统的发育

离子型谷氨酸受体分为NMDA型和非NMDA型两类,其中NMDA型受体与中枢神经系统发育关系密切。本文综述了NMDA受体的分子特性及NMDA受体五种亚单位NR1、NR2A、NR2B、NR2C和NR2D在动物出生后脑内的时空表达;NMDA受体亚单位在发育中的作用以及NMDA受体活性的胞内调节机制。     

硝酸还原酶的研究——Ⅲ.硝酸还原酶钝化蛋白的专一性及其对硝酸还原酶的水解作用

以同样的提取方法,分别从小麦叶片、曼陀罗愈伤组织中提取的硝酸还原酶(NR)钝化蛋白均可明显钝化小麦、水稻、玉米等叶片的NR,而从水稻、豌豆叶片中提取的NR钝化蛋白也均可明显钝化小麦叶片NR的事实显示出植物体内NR钝化蛋白存在的普遍性及不同植物种间这种钝化蛋白作用的共同性。水稻叶片及曼陀罗愈伤组织NR钝化蛋白只能钝化NR,而不能钝化与NR同为植物氮素同化关键酶的亚硝酸还原酶(NiR),小麦叶片NR钝化蛋白只能钝化NR而不能钝化与NR同为诱导酶的α-淀粉酶又表明NR钝化蛋白对NR的钝化作用具有一定的专一性。在小麦叶片NR钝化蛋白(部分Ⅰ)与NR一起保温时,同时加入作为水解酶抑制剂的大豆胰蛋白酶抑制物或丝氨酸酶抑制物PMSF,均可部分解除钝化蛋白的钝化效力,可作为此种钝化蛋白是个水解酶的进一步证明。     

水稻硝酸还原酶的RNA干涉及其酶活性分析

分析水稻硝酸还原酶（NR）基因生物信息学的结果显示：水稻基因纽中有2个NR基因成员：一个为NR[NADH]（NR1）：另一个为NR[NAD（P）H]（NR2）。两者的蛋白序列相似性为70％。用RT—PCR技术从水稻cDNA中获得了NR1和NR2的cDNA片段,其大小分别为1086bp和892bp。构建RNA干涉载体（称pRNAi—NR1和pRNAi-NR2）转化水稻愈伤组织后检测转基因后代酶活性的结果表明：两种干涉植株的根叶中的NR活性均大幅度下降,并且根叶中的活性变化呈线性正相关关系。表明2个基因可能均有调控根叶中NR活性的作用。     

NR2B亚基1472位点酪氨酸磷酸化在低氧/缺血中的神经保护作用

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)离子型谷氨酸受体,NR2B亚基作为其重要组成部分,在大脑的各种生理过程中发挥着重要作用。NR2B亚基包含多个酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点,在低氧/缺血条件下,通过NR2B磷酸化变换使神经细胞对其产生应答。本文对NR2B亚基酪氨酸1472磷酸化及其在低氧/缺血情况下发挥的生理学功能进行综述,为低氧/缺血神经保护研究提供思路。     

茶树硝酸还原酶基因克隆及表达分析

利用茶树全器官转录组文库中硝酸还原酶(NR)的EST,通过RACE技术扩增出NR基因的cDNA,并利用实时荧光定量PCR检测了NR基因在不同茶树品种中的表达。结果表明:NR基因cDNA全长2 927bp,开放阅读框2 652bp,编码一个有884个氨基酸蛋白质,GenBank登录号为JX987133。经BlastX比对,与GenBank中登录的烟草NR相似性达到74%。茶树NR蛋白属于亲水性蛋白,可能为胞质蛋白。25个茶树品种叶片中NR表达水平差异明显,最高值是最低值的22.75倍。因NR是植物氮代谢过程中的关键限速酶,推测25个茶树品种间氮吸收利用能力存在差异。     

NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定

构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19–393 aa)、NR1-S1(编码394–544 aa)和NR1-S2(编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒p Cold-SUMO-M1和p Cold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。     

硝酸还原酶的研究——Ⅰ.小麦叶片硝酸还原酶—钝化蛋白的分离和特性

从小麦叶片得到的硝酸还原酶(NR)-钝化蛋白用作钝化小麦叶片NR。通过硫酸铵分级分离和Sephadex G-100柱纯化的小麦蛋白分为两个部分,对NR都有明显的钝化活力,但又有着不同的性质。在Tris-甘氨酸缓冲液系统中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时,钝化蛋白部分Ⅰ的蛋白下移缓慢,保持在起端,而钝化蛋白部分Ⅱ的蛋白则下移迅速,接近底端。对NR的钝化作用,钝化蛋白部分Ⅱ明显高于同样量的部分Ⅰ。钝化蛋白部分Ⅰ的最适pH为7.5,部分Ⅱ的最适pH为6.5。钝化蛋白部分Ⅰ和部分Ⅱ对NR的作用方式也不同。前者对NR无明显水解作用,后者对NR有较强水解作用且与NR-起预保温后在Sephadex G-75柱上移动性无明显变化。小麦叶片NR-钝化蛋白部分Ⅱ可能是个特异的水解蛋白,而钝化蛋白部分Ⅰ可能不是个水解蛋白。     

NADH-硝酸还原酶组分酶的活性测定

NADH—硝酸还原酶(NADH—nitrate reduc—tase,EC 1.6.6.1,NADH—NR)是硝态氮同化的关键酶,它能以NADH为电子供体,还原NO_3~-为NO_2~-。由于它在植物氮代谢中的重要作用,国内外已对它的诱导和活性调节进行了广泛的研究。 NADH—NR是组分酶复合物,改变电子供体或受体,可测到 NADH—NR的二个组分酶活性,     

NR4A1对糖脂代谢的调控作用

孤核受体NR4A1又被广泛地称为Nur77, TR3或NGFI-B等,是核受体NR4A家族中的重要成员,它作为转录因子,对体内多种生理过程都起到直接或间接的调控作用.本综述根据该领域的研究进展,以及本实验室的相关研究,对NR4A1在糖脂代谢中的调控作用进行了简短的综述.在胰岛β细胞中,持续高糖高脂的压力会引起细胞的内质网应激和氧化应激,而NR4A1能够抵抗由其引起的细胞凋亡,从而缓冲或阻止糖尿病的发生和发展.在脂肪组织中, NR4A1能够抑制脂肪细胞分化和脂质的生成,从而影响肥胖的发生和发展.