抗对虾白斑综合症病毒单链抗体A1基因在酵母中表达及其与抗原结合活性

通过PCR从噬菌粒载体上扩增一种抗对虾白斑综合症病毒 (WSSV)的单链抗体A1(ScFvA1)基因 ,并构建于大肠杆菌 酵母穿梭质粒载体pPIC9K上。经PCR ,酶切 ,测序鉴定重组克隆 ,发现重组成功。将重组质粒pPIC9K ScF vA1转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115中 ,利用甲醇诱导 ,将单链抗体A1在酵母中进行了初步表达。经SDS PAGE电泳 ,发现其大小约为 32KD ,通过ELISA实验 ,证明表达上清液中的单链抗体具有很高的WSSV结合活性。     

抗对虾白斑综合症病毒单链抗体P1D3基因在毕赤酵母中的分泌表达

为了将可中和对虾白斑综合症病毒(WSSV)的单链抗体P1D3在酵母中实现表达,以原核表达载体M13噬菌粒为模板,设计带有SnaBⅠ和EcoRⅠ酶切位点的特异性引物,通过PCR方法扩增P1D3基因。经过酶切、连接反应将该基因连入大肠杆菌-酵母穿梭质粒pPIC9K上。重组质粒pPIC9K-scFvP1D3经BglⅡ线性化后,用电转化的方法转入毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中。通过PCR和DNA测序,挑选和鉴定阳性克隆。经甲醇诱导,P1D3在酵母中获得分泌表达。ELISA实验结果表明,酵母表达上清液中的单链抗体具有较高的WSSV结合活性,而且其活性要高于大肠杆菌所表达抗体的活性。表达条件优化后,单链抗体在酵母中最高表达量可达302mg/L,为开展对虾被动免疫研究提供了新的抗体来源。     

一种抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)线性抗原表位单链抗体的筛选

对虾白斑综合症病毒(WSSV)是全世界对虾养殖业最主要的病原体之一, 虽然对该病毒的研究已较为深入, 但目前仍无有效的防治方法。本研究应用噬菌体展示技术, 构建了抗变性WSSV的单链抗体噬菌体展示文库, 分别以WSSV病毒粒子和原核表达的囊膜蛋白VP28为靶分子对该文库进行淘选。经过数轮淘选后, 得到5个能特异识别WSSV的单链抗体, 且首次获得了能特异识别WSSV线性抗原表位的单链抗体P75E8。并通过免疫胶体金电镜分析, 对5种单链抗体对应在病毒粒子上的表位进行了定位。为获取识别多种WSSV抗原的抗体提供了新的方法路线, 也为获取特异性识别线性表位的单链抗体提供了一种新的淘选技巧。     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp 19的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp19基因并克隆到pGEM‐T载体中,经过BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切、连接并将vp19插入到pET32b表达载体中.用重组质粒pET32b-vp19转化大肠杆菌Origami(DE3)pLysS,在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-VP19以可溶性的形式得到表达,经SDS-PAGE和Western-blot检测显示其分子量与预期的大小相符合.目的蛋白经Ni2+柱纯化并定量后分别直接注射鳌虾和包被饲料投喂鳌虾.实验结果表明注射Trx-VP19可以提高鳌虾个体抗WSSV感染力的作用.     

对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP28的原核表达和性质研究

VP2 8是对虾白斑综合症病毒 (Whitespotsyndromevirus ,WSSV)的一个重要的囊膜蛋白。为了便于研究VP2 8在和宿主细胞相互作用过程中扮演的角色 ,将VP2 8基因克隆到一个原核表达系统 ,对原核表达的VP2 8的特性进行了研究 ,并制备了抗VP2 8的多克隆抗体和单链抗体 ,对原核表达的和天然病毒的VP2 8蛋白免疫原性进行了比较。结果表示 ,原核表达的VP2 8与天然蛋白具有相似的免疫原性。     

对虾白斑综合症病毒结构蛋白60B的原核表达和其基本氨基酸序列的初步分析

VP60B是对虾白斑综合症病毒(WSSV)中含量很少的一个结构蛋白。VP60B的一段序列与腺病毒纤维蛋白(Adenovirus type 5 fiber protein)的knob domain的一段序列具有同源性。本试验将VP60B基因克隆到原核表达系统中,在低温条件下,诱导了VP60B蛋白的表达。结果显示VP60B在该系统主要是以包含体的形式存在。原核表达的VP60B不能被鼠抗WSSV多克隆血清所识别,预示该蛋白的免疫原性较弱。通过对VP60B氨基酸序列的分析,发现有一个跨膜区,这预示着该蛋白可能位于WSSV病毒的囊膜上。     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp19的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp19基因并克隆到pGEM‐T载体中,经过BamHⅠ/HindⅢ酶切、连接并将vp19插入到pET32b表达载体中。用重组质粒pET32b-vp19转化大肠杆菌Origam(iDE3)pLysS,在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-VP19以可溶性的形式得到表达,经SDS-PAGE和Western-blot检测显示其分子量与预期的大小相符合。目的蛋白经Ni2 柱纯化并定量后分别直接注射鳌虾和包被饲料投喂鳌虾。实验结果表明注射Trx-VP19可以提高鳌虾个体抗WSSV感染力的作用。     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28的表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pET22b-vp28并转化大肠杆菌BL21(DE3).基因工程菌株37℃IPTG诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小32kDa相符合的目的蛋白.用Ni2+-柱纯化的目的蛋白分别直接注射螯虾和包被饲料投喂螯虾,实验结果表明vp28在大肠杆菌中的表达产物有显著提高虾体抗WSSV感染力的作用,而且注射效果更好.     

白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19、VP28的融合表达及中和抗体的制备

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp19和vp28的序列,设计并合成两对引物,PCR扩增得到vp19和vp28两基因,大小分别为370bp和630bp.通过EcoRI位点连接两基因,再按正确的阅读框插入表达载体pET-22b(+)中,构建出重组表达载体pET-vp(19+28)并转化大肠杆菌BL21(DE3).基因工程菌株35℃IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE检测显示有与预期大小41kDa相吻合的融合蛋白带.用Ni2+-柱纯化的基因工程蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,进行螯虾活体中和病毒实验,结果表明抗血清对WSSV的中和效率达到了100%.     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28的表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pET22b-vp28并转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌株37℃IPTG诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小32kDa相符合的目的蛋白。用Ni2 -柱纯化的目的蛋白分别直接注射螯虾和包被饲料投喂螯虾,实验结果表明vp28在大肠杆菌中的表达产物有显著提高虾体抗WSSV感染力的作用,而且注射效果更好。     

对虾白斑综合征杆状病毒同源性比较的研究

比较我国沿海不同海域对虾白斑综合征杆状病毒三个分离株：即唐海分离株（渤海湾）、宁波分离株（东海）,深圳分离株（南海）的同源性。三个WSSV分离株基因组的限制笥内切酶（Sac Ⅰ,HindⅢ,PstⅠ）酶切多态（RFLP）以及病毒结构蛋白图谱完全一致,证实造成我国从南对北对虾爆发性流行病的对虾白斑杆状病毒为同一种病毒。利用高保真Taq酶,分别以报道的日本对虾杆状病毒（RV－PJ－PRDV）,斑节对虾白斑综合征杆状病毒（WSBV－PmNOBⅢ）基因组核酸片段特异性引物进行PCR扩增,结果均能从中国一杆状病毒（WSSV）基因组中扩增得到相应大小的PCR产物,扩增产物序列分析表明中国对虾白斑杆状病毒（WSSV）与斑节对虾白斑综合征杆状病毒（WSBV－PmNOBⅢ）,日本对虾相状RV-PJ=PRDV)同源率分别为100％与97％,其结果为证实亚洲及太平洋地区对虾白斑综合征杆状病毒为同一种病毒或同一种病毒的不同株系提供了依据。     

用简并寡核苷酸探针筛选对虾白斑综合征病毒DNA多聚酶基因片段

根据一些病毒的DNA多聚酶氨基酸序列中特有的保守序列VYGDTD设计的简并寡核苷酸 ,经地高辛标记后与对虾白斑综合征病毒基因库克隆杂交 ,筛选出一段长度为 70 7bp的EcoRI基因片段 ,该片段在一个开放阅读框内。并含DNA多聚酶B家族特有的保守序列YGDTDS。经与基因库比较 ,其氨基酸序列与藻类DNA病毒科 (Phycodnaviridae)的几株藻类病毒的DNA多聚酶片段有部分相似 ,因此推测该核苷酸片段为对虾白斑综合征病毒DNA多聚酶基因的部分序列。     

对虾白斑综合征杆状病毒体内增殖模型的建立

应用对虾白斑综合征杆状病毒（WSSV）,对淡水克氏螯虾、罗氏沼虾、日本沼虾和两种淡水蟹（中华绒螯蟹、长江华溪蟹）进行人工感染实验。结果除淡水克氏螯虾之外,其它受试的虾蟹均不能感染WSSV。克氏螯虾3个不同剂量级感染至12d平均死亡率为94％。从发病或死亡个体采集血淋巴,经电镜负染色可观察到完整的病毒粒子,其形态大小、靶细胞组织病理均与从中国对虾中分离的WSSV相似或相同。同时,通过原位杂交技术进一步证明该实验的可靠性。克氏螯虾重复感染效果良好,有可能成为研究WSSV的一种理想的病毒体内增殖模型。     

从噬菌体展示抗体文库筛选对虾白斑综合征病毒的单链抗体

对虾白斑综合征是一种严重危害对虾养殖业的病毒性疾病.由于目前对其病原体对虾白斑综合征病毒（WSSV）的研究不够深入,所以对WSSV的有效防治仍然是一大难题.为此,用完整的对虾白斑综合征病毒粒子作为靶抗原固相包被,淘选噬菌体展示单链抗体文库,得到两个能够与WSSV结合的单链抗体：E2和H4.单链抗体H4能够结合病毒并抑制病毒对原代培养的对虾淋巴细胞的感染,这些结果表明此单链抗体具有开发为诊断试剂盒和抗病毒药物的潜力.     

Expression and purification of an anti-Foot-and-mouth disease virus single chain variable antibody fragment in tobacco plants

Low-cost recombinant antibodies could provide a new strategy to control Foot-and-mouth disease virus (FMDV) outbreaks by passive immunization of susceptible animals. In this study, a single chain variable antibody fragment (scFv) recognizing FMDV coat protein VP1 was expressed in transgenic tobacco plants. To enhance the accumulation of scFv protein, the codon-usage of a murine hybridoma-derived scFv gene was adjusted to mimic highly expressed tobacco genes and fused to an elastin-like polypeptide (ELP) tag. This scFv–ELP fusion accumulated up to 0.8% of total soluble leaf protein in transgenic tobacco. To recover scFv–ELP protein from the leaf extract, a simple and scalable purification strategy was established. Purified scFv–ELP fusion was cleaved to separate the scFv portion. Finally, it was shown that the purified scFv proteins retained their capacity to bind the FMDV in the absence or presence of ELP fusion. Electronic supplementary material  The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

Cloning, expression, purification and characterization of a single chain variable fragment specific to tumor necrosis factor alpha in Escherichia coli

Anti TNF-α molecules have been used as therapeutic agents in a variety of human diseases such as Rheumatoid arthritis, Ankylosing spondylitis, Chron's diseases, Psoriasis, etc., where high levels of TNF-α plays a destructive role. The limitations of the present TNF-α inhibitors in terms of size, tissue penetration and immunogenicity, etc., provoked the search for small anti TNF-α molecules. In the present study, a single chain variable fragment (ScFv) construct was made from a monoclonal antibody of the class IgG raised against TNF-α was used. The anti TNF-α ScFv was well expressed as soluble form in Escherichia coli BL21 (DE3), which was purified to homogeneity by commercial methacrylate monolith-convective interaction media (CIM) supports using two different chemistries, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) with copper ions followed by anion exchange chromatography. The anti TNF-α ScFv found to be inhibiting the TNF-α mediated cytotoxicity in MCF-7 cells with an IC₅₀ of 8 μg. Data presented here are promising and encouraging to further optimize anti TNF-α ScFv production in larger scale with higher recovery at a cheaper price for therapeutic purposes.     

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。     

Production and Characterization of Monoclonal Antibodies of Shrimp White Spot Syndrome Virus Envelope Protein VP28

BALB/c mice were immunized with purified White spot syndrome virus (WSSV). Six monoclonal antibody cell lines were selected by ELISA with VP28 protein expressed in E. coli. in vitro neutralization experiments showed that 4 of them could inhibit the virus infection in crayfish. Western-blot suggested that all these monoclonal antibodies were against the conformational structure of VP28. The monoclonal antibody 7B4 was labeled with colloidal gold particles and used to locate the VP28 on virus envelope by immunogold labeling. These monoclonal antibodies could be used to develop immun-ological diagnosis methods for WSSV infection.