蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

人细胞核dUTPase的克隆表达及其酶学活性

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dUTPase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dUTPase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dUTPase蛋白及GST dUTPase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dUTP活性 ,但融合蛋白的活性比dUTPase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2 +和EDTA对酶活性的影响     

肿瘤相关抗原基因HCA520重组蛋白的表达纯化及其肝癌患者血清中相应抗体的分析

HCA5 2 0是用SEREX(serologicalidentificationofrecombinantcDNAexpressingcloning)方法 ,即用肝癌病人血清从肝癌组织cDNA表达文库中筛选得到的肝癌相关性抗原编码基因 .利用RT PCR技术检测了HCA5 2 0mRNA在各种组织中的分布情况 ,构建了GST融合表达载体并且用亲和层析的方法纯化表达的融合蛋白 .最后用Western印迹检测了重组蛋白的免疫反应性 ,用斑点印迹检测了肝癌病人血清中HCA5 2 0的天然抗体的存在情况 .结果表明 ,HCA5 2 0在各种组织中呈丰度差异分布 ,构建好的pGEX 4T 3重组载体经IPTG诱导后高效表达GST HCA5 2 0融合蛋白 ,其分子量约 4 9kD .经GST Agarose亲和层析 ,重组蛋白得到高度纯化 .Western印迹证实 ,纯化蛋白为目的重组蛋白 ,重组蛋白具有与天然蛋白相同或相似的免疫反应性 .斑点印迹分析表明 ,2 0份肝癌病人血清中有 1份HCA5 2 0抗体阳性 ,而 4份正常人均为阴性 .HCA5 2 0的足量提供 ,可用以研究其在致癌中的作用 ,并可以免疫动物制备抗体 .它作为抗原 ,分析其抗体在不同肿瘤病人中的表达情况 ,评估其在临床肿瘤诊断中的作用     

重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的构建与表达

目的构建表达重组胸腺素α1（Tα1）的pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌。方法将人工合成的Tα1序列进行PCR扩增,将扩增的片段和pMAL-C2x质粒载体分别经BamHI和EcoR I双酶切后,用T4 DNA快速连接酶连接构建pMAL-C2x-Tα1融合表达质粒,再经测序正确后,将重组体转化至大肠埃希菌TB1菌中,pMAL-C2x-Tα1/TB1菌在LB液体培养基中培养,经IPTG诱导表达麦芽糖结合蛋白与Tα1的融合蛋白（MBP-Tα1）,采用Westernblot对MBP-Tα1进行鉴定。结果 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌能有效表达MBP-Tα1,融合蛋白占菌体蛋白的33.6%,分子量约为45×103。结论工程菌的成功构建和表达为重组Tα1的纯化、生物学活性等研究奠定了基础。     

重组人肝刺激物在原核细胞中的表达与纯化

利用基因重组技术 ,构建成人肝刺激因子 (hHSS)和谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL 2 1(DE3 ) ,以His·Tag亲和层析纯化表达产物 ,FactorXa切割分离hHSS单体 ,并检测其生物学活性。结果显示 ,在pET 4 2a表达体系中hHSS以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在 ,GST hHSS表达量占菌体可溶性蛋白的3 0 % ;FactorXa切割GST与hHSS之间肽腱 ,得到 3 3和 15kD两条蛋白带 ,经Western杂交证实 3 3kD条带为GST ,而 15kD条带的分子量与hHSS基因序列推测蛋白结果相符。经His·Tag再次纯化可获得hHSS单体 ,初步证实重组hHSS具有促进肝癌细胞增殖活性     

肿瘤转移相关基因syntenin的融合表达及纯化

肿瘤相关基因syntenin在乳腺癌的转移和浸润过程中发挥重要作用。syntenin基因编码蛋白的C端有2个串联的PDZ(PDZ1和PDZ2)结构域,它们与该蛋白的功能密切相关。PDZ结构域存在于多种蛋白质中。用PCR方法扩增了syntenin全长、N端（ΔPDZ)、串联重复的PDZ(2PDZ)、PDZ1和PDZ2结构域编码序列,并将其以正确相位与pGEX-2T载体中的GST序列编码融合,构建成重组质粒pGST-syntenin、pGST-ΔPDZ、pGST-2PDZ、pGST-PDZ1和pGST-PDZ2。将这些重组质粒分别转化E．coli DH50α后,分别表达了相应的GST融合蛋白。Westem blot检测结果表明,2种融合蛋白均能与GST抗体反应。表达的GST融合蛋白经谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析获得了纯化的融合蛋白,为PDZ结构域及其相关蛋白功能研究提供了有用的材料。     

人凋亡相关基因TFAR19缺失突变体的原核表达、产物纯化及鉴定

构建TF 1细胞凋亡相关基因 19(TF 1cellapoptosisrelatedgene 19,TFAR19)缺失突变体的原核表达载体 ,获取缺失突变体蛋白 ,用于TFAR19促凋亡分子机理的研究 .从真核表达载体pcDI TFAR19扩增出野生型TFAR19和 4个缺失突变体 ,重组到原核表达载体pGEX 4T 2 .经亲和层析方法对缺失体蛋白进行纯化后 ,再利用凝胶过滤的方法进一步纯化 .利用抗GST和抗TFAR19的单克隆抗体对蛋白进行免疫学鉴定 .用白血病细胞株HL 6 0检测蛋白活性 .成功地克隆并重组了野生型TFAR19及缺失突变体 pGEX 4T 2表达载体 ,对融合蛋白的表达条件进行了优化 .SDS PAGE结果显示 ,各个缺失突变体融合蛋白均有较高水平的表达 .免疫学检测证实获得了正确的表达产物 .活性检测证实 ,野生型TFAR19和缺失突变体 4可以明显促进去血清诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,第 6外显子可能是一个与TFAR19促凋亡活性密切相关的功能结构域     

完整弓形虫P35重组蛋白IgM-酶联免疫吸附测定法检测弓形虫急性感染

为利用重组的完整弓形虫表面抗原P35 GST蛋白对弓形虫感染进行血清学诊断 ,构建了可表达P35 GST的JM10 9细胞株 .采用亲和层析对融合蛋白进行分离和纯化 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹 (Westernblot)分析所表达的蛋白质 ,并用纯化的重组蛋白进行IgM 酶联免疫吸附测定法 (IgM ELISA)检测不同病人血清中的抗 P35抗体 .SDS PAGE分析发现P35 GST重组蛋白的大小约 6 0ku ,为一亲水性蛋白 ,蛋白质印迹分析表明该蛋白与弓形虫阳性感染病人的血清有特异性反应 .利用P35 GST为抗原 ,对 6 0例血清进行IgM ELISA分析 ,发现P35 GST可明显区分近期感染和既往感染 ,在弓形虫的诊断上有很大的应用前景 .     

幽门螺杆菌Lpp20融合蛋白的表达、标签切除及鉴定

目的:利用GST融合基因表达系统表达Lpp20-GST融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签.方法:IPTG诱导重组质粒Lpp20/pGEX-4T -1在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,发现Lpp20-GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达.采用GST蛋白纯化系统对其纯化,得到Lpp20- GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western Blot鉴定.结果:高效表达出Lpp20-GST融合蛋白的相对分子质量约4.5kDa,凝血酶成功切除了GST标签,Western Blot证实Lpp20蛋白能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别.结论:成功表达和纯化了重组Lpp20蛋白,为深入研究Lpp20的功能奠定了基础.     

转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP 1的功能     

杨梅铜锌超氧化物歧化酶基因(MrCu/Zn-SOD1)的原核表达及活性鉴定

为获得高表达杨梅(Morella rubra)铜锌超氧化物歧化酶(MrCu/Zn-SOD1)的工程菌,本实验采用RT-PCR技术从杨梅果实中分离扩增了MrCu/Zn-SOD1的cDNA序列(456bp),将该基因重组到原核表达载体pGEX-2T中,酶切、测序分析表明,重组质粒pGEX-MrCu/Zn-SOD1结构正确。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。IPTG诱导表达分子量约41kD融合蛋白GST-MrCu/Zn-SOD1。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽亲和层析纯化,得到高纯度的GST-MrCu/Zn-SOD1。采用氯化硝基四氮唑蓝法和黄嘌呤氧化法分析其活性。结果表明,GST-MrCu/Zn-SOD1具有特异性SOD酶活性。     

重组人胰高血糖素样肽-1的表达、纯化及其生物学活性

为获得重组人胰高血糖素样肽 1[recombinanthumanglucagon likepeptide 1(7～ 37) ,rhGLP 1]并研究其生物学活性 ,采用亚磷酸二酯法合成hGLP 1cDNA的 6个寡核苷酸片段 ,拼接成完整的hGLP 1cDNA ,构建重组质粒pGEX hGLP 1,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达菌株 .高密度发酵培养的菌体超声破碎后 ,裂解液用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到GST融合蛋白 .经CNBr裂解、QAE SepharoseFF柱层析和脱盐 ,得到纯度大于 90 %的rhGLP 1,质谱测定分子量结果与理论值一致 .生物学活性分析表明 ,rhGLP 1具有明显的降血糖活性 .     

骨桥蛋白RGD黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化及生物学活性测定

目的:用大肠杆菌表达骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽,经分离纯化后检测其生物学活性.方法:运用基因重组技术,将骨桥蛋白RGD黏附序列的核酸片段首尾相连,与携带GST编码序列的原核表达载体连接构建融合蛋白表达质粒pGEX-3X-RGD.将重组质粒转化宿主菌后,对诱导融合蛋白表达的条件进行优化.表达产物GST-RGD经谷胱甘肽-亲和层析纯化后,分别检测其对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移的影响.结果:所构建的含有6个拷贝短肽的GST-RGD融合蛋白可在大肠杆菌中以包含体的形式进行表达.用十二烷基肌氨酸钠变性溶解包含体及透析复性后,经亲和层析可得到高纯度的GST-RGD(6)融合蛋白.GST-RGD(6)融合蛋白能特异性的抑制骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞的黏附和迁移.结论:骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽可在大肠杆菌中高效表达,纯化的GST-RGD融合蛋白具有抑制血管平滑肌细胞黏附和迁移的活性.     

人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 ,为下阶段深入AWP1功能研究提供了重要的基础     

鸡β-防御素7在大肠杆菌中的表达及活性分析

【目的】根据鸡β-防御素7(Gal-7)的成熟肽基因序列合成基因,构建表达Gal-7的大肠杆菌工程菌,研究重组鸡防御素Gal-7成熟肽的体外生物活性。【方法】将合成的gal-7基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1中,得到重组质粒pGEX-6p-gal7,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达得到含GST标签的融合蛋白GST-Gal7;之后用Prescission蛋白酶将GST标签切除,并对成熟肽进行质谱分析;再利用琼脂打孔扩散法检测Gal-7成熟肽的体外抑菌活性,用2倍稀释法测定对指示菌的最低抑菌浓度。【结果】成功构建Gal-7大肠杆菌异源表达工程菌,表达纯化的重组Gal-7成熟肽质谱鉴定分子量为5 516 Da,其对黄色微球菌(NCIB 8166)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、粪肠球菌(ATCC 29212)、大肠杆菌(CMCC 44102)均有抑菌活性,最低抑菌浓度分别为16.875、67.5、67.5、135 mg/L。【结论】获得表达鸡Gal-7成熟肽的大肠杆菌工程菌,并且切除GST标签的Gal-7成熟肽具有生物活性。     

家蝇防御素在大肠杆菌中的表达、纯化与抗体制备

家蝇防御素是从家蝇中克隆得到的1种抗菌肽。为了进一步研究家蝇防御素的功能和制备特异性抗体,采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法, 进行了家蝇防御素原核表达的研究。根据克隆到的家蝇防御素基因(Mdde) 的cDNA序列, 设计特异性引物, PCR 扩增成熟肽的cDNA片段, 将成熟肽序列重组到表达载体pGEX 4T 1中, 构建m Mdde/pGEX 4T 1重组表达载体, 在大肠杆菌BL21 中诱导表达, 重组表达的融合蛋白GST Mdde占菌体总蛋白的33 4%。纯化得到GST Mdde后, 再用凝血酶将其从特定位点切开, 得到表达的m Mdde。液体抑菌实验结果初步表明, 表达的融合蛋白GST Mdde对细菌生长有一定的抑制作用。利用纯化的GST Mdde融合蛋白, 制备了抗血清。     

分选酶A(SrtA)的GST融合表达、纯化及活性测定

构建GST/金黄色葡萄球菌分选酶A (SrtA)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化分选酶,并利用展示在酵母表面的底物检测分选酶的活性.以pMD20-SrtA为模板,PCR扩增得到SrlA△N59基因,经BamH I和Xho I双酶切,连接到原核表达栽体pGEX-4T-1中,构建重组表达栽体pGEX-SrtA△N59,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,GST亲和层析分离纯化得到SrtA△N59,与展示在酵母表面的底物序列QALPETGEE-linker-EGFP作用,产生游离的EGFP,通过酶标仪检测EGFP荧光强度确定分选酶的活性.结果显示,重组表达栽体pGEX-SrtA△N59经IPTG诱导,表达出相对分子质量约为42 kD的融合蛋白,SDS-PAGE分析,该融合蛋白是以可溶形式表达.分离纯化得到的分选酶与底物作用,其荧光强度由568.66±12.14增加至921.43±13.02.以上结果表明,成功构建了重组表达裁体pGEX-SrtA△N59,并在大肠杆菌中获得了可溶表达的有活性的分选酶.     

肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .     

pGEX-4T-1/Tα1-TP5原核表达载体的构建及表达

旨在构建胸腺融合肽Tα1-TP5原核表达载体,并在大肠杆菌中表达.化学合成Tα1-TP5基因,与原核表达载体pGEX-4T-1融合并转化至E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统对工程茵表达的蛋白进行分析鉴定.表达的GST融合蛋白经GST琼脂糖...