PVA固定化的生黑醋菌生产L-山梨糖的研究

生黑醋菌可以将D-山梨醇转化为L-山梨塘,用微生物将D-山梨醇氧化为L-山梨糖是维生素C生产的一个重要部分,目前工业上用的都是游离菌批式生产工艺。由于固定化活细胞作为生物催化剂具有生产的连续性和稳定性．操作简便．产物易于分离纯化等优点^[1],已有不少实验室研究甩固定化微生物细胞将D-山梨醇转化为L-山梨糖^[1-6],国内也有用海藻酸固定化生黑醋菌Acetobacteriummelanogenum的报道^[2,3]。用海藻酸钙^[1-3]、聚丙烯酰胺^[4]、铝处理的海藻酸钙^[5]、水合聚丙烯酰胺与海藻酸钙混合固定化的微生物细胞^[6]转化D-山梨醇成为L-山梨糖,都有因机械强度差,而不适合在搅拌式发酵罐中生产的弱点。聚乙烯醇制备的固定化微生物细胞具有机械强度好、类似于橡皮的弹性、成低等特性^[7]。因此,我们选择聚乙烯醇作为固定化生黑醋菌的材料。     

固定化硝化细菌耐低温机理的研究

氨随污水排入水体．不但能诱发“富营养化”,造成水生生态系统紊乱,而且还有如下危害：(1)消耗溶解氧,导致水体缺氧;(2)影响鱼鳃的氧传递,严重时使鱼类死亡;(3)与氯气作用生成氯胺,妨碍氯化消毒处理^[1]。对于氨污染的控制．目前国内外主要采用生物脱氮技术。即硝化．反硝化工艺^[2]。由于硝化细菌生长缓慢(在低温下则生长更慢)．一些学者作了固定化细胞的尝试．以期持留足量的生物体,改瞢生物反应器的运作性能^[3,4]。研究发现,固定化硝化细菌具有较强的耐低温能力^[4]。这对含氨废水的冬季生物处理十分有益。本文拟就固定化细胞的耐低温机理作一探讨。     

利用渗透交联固定化细胞促进生物转化

固定化技术已在生物工程中得到广泛的实际应用,特别是应用于生物转化以提高酶或细胞的稳定性,实现连续操作等。对于含胞内酶的细胞的生物转化．一般先破碎细胞,使酶释放出来,再进行酶固定化。由于酶的稳定性通常与细胞膜的结台有关^[1],细胞破碎中常导致酶的失活。如果不破碎细胞,对完整细胞固定化,又会有传质困难抑制酶活力的发挥。我们研究出渗透交联固定化细胞技术以解决这个矛盾。先采用某种试剂(多为表面活性剂)处理细胞,提高细胞的通透性,再进行交联固定化．可以保证酶的活力破坏较小,又减小了传质阻力。既提高了固定化细胞的稳定性,又提高了固定化细胞的表观酶活。称这种固定化技术为渗透交联固定化细胞技术。Prabhuaney等采用CTAB-戊二醛处理聚丙烯酰胺凝胶包理的含青霉素酰化酶E. coli细胞^[2]。Nmhida采用1,6-己二胺-戊二醛处理含天冬氨酸酶的E．Coli细胞^[3]。渗透交联固定化处理会损伤细胞和酶是这种技术的一个矛盾。本文采用多乙烯多胺-戊二处理方法．因多乙烯多胺既起到表面活性剂的作用．又是交联剂。而且渗透能力比CTAB和1,6-已二 胺为低,故对细胞和酶损伤较小。     

固定化技术研究的新进展

固定化生物催化剂的研究近一、二十年来发展非常迅速。它已由原来的单一固定化酶、固定化微生物细咆发展到动植物细胞、组织器官、微生物孢子^[1]、细胞与酶^[2]、好氧微生物与厌氧微生物^[3]的混合固定化等,其应用研究巳涉及发酵、食品、化工、分析、医疗、生化、环境净化等各个领域^[4],展示了广阔的发展前景。     

P2-DNA的转染及提纯

P₂-DNA即Phage 2型噬菌体的染色体DNA,是一条线状双股螺旋的DNA分子,分子量为2．2×10⁷Da。有19个碱基的牯性末端．可以连接成环状^[1]．1970年Bertani L.E. 和 Bertani G分离纯化得到P₂噬苗体并对其遗传学及理化特性进行了研究^[2],发现它在DNA复制,溶源性的控制以及基因重组等方面与温和性λ菌体不同;1979年Saint R B 等和Westoo A等先后研究了P₂-DNA的几种限制酶的切割图谱^[3]。P₂-DNA可望成为分子生物学研究的重要工具和实验材料。目前国内尚无这种材料．我们试图将少量的P₂-DNA转染获得P₂噬菌体,加以扩增纯化．抽提得到大量的P₂-DNA。为分子克隆和限制酶的研究提供有实用价值的材料和研究工具。     

真菌-氧化氮还原酶细胞色素P-450nor 2 cDNA序列的测定

在真菌的反硝化作用中,一种细胞色素P-450起着一氧化氮还原酶的作用,被称为细胞色素P-450nor^[1]。最近的研究发现：真菌细胞色素P-450nor有三种类型。除了缣孢菌(Fusarium oxysporum)P+450nor(即F．P-450nor)外。还有两种存在于柱孢菌(Cylindrocarpon tonkinense)．即C. P-450norl和2^[2]。 F．P-450nox和C．P-450norl能以NADH为直接的电子供体,使NO还原生成N₂O。C. P-450nor2不仅能直接利用NADH。而且能直接利用NADPH．还原NO生成N₂O。F. P-450nor基因已被克隆和测序^[3-4]。本文测定了C．P-450nor2的eDNA编码区全序列,3’非编码区部分序列和5’引导序列。     

色谱反应分离器中青霉素G的水解特性

6-氨基青霉烷酸(6-APA)是半合成青霉素的关键中间体,通常采用固定床反应器在青霉素酰化酶作用下水解青霉素来制备^[1]。由于该反应是典型的产物抑制可逆反应,工业生产中需不断加碱中和苯乙酸,以维持反应在最适pH条件下进行。为进一步提高青霉素的水解速率,除了维持最适反应条件外．消除产物抑制具有重要作用。近年来一些研究者提出采用伴有分离作用的反应分离组合系统水解青霉素 制取6-APA。Ishimura等^[2]采用电渗析膜耦合式生物反应器连续移除苯乙酸．将反应速率提高了近1倍;陈坚等^[3]研究了固定化酶-离子交换组合系统移除苯乙酸过程。本文报道青霉素在生化反应与液相谱分离过程相耦合而形成的色谱反应分离器中的水解特性。     

人工神经网络在米曲霉菌体固定化研究中的应用

在液体培养基中,将米曲霉3042菌体培养成直径为1～2mm、菌壁上含较高氨基酰化酶浓度的菌丝球,以甲醛为交联剂,明胶为酶活性保护剂对米曲霉菌丝球进行固定化研究。在正交实验L₁₆(4⁵)的基础上,选用结构为410-15-1的BP(Back propagation)人工神经网络,对固定化工艺条件进行优化和预测,得到了优化的固定化条件。实验测定在此条件下制备的固定化米曲霉菌体比酶活为1500u,比酶活保留率达到83%,说明人工神经网络可以用于米曲霉菌体固定化工艺条件的优化。     

云南红豆杉培养细胞系的建立

紫杉醇(Taxol)最初是从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出的一种二萜类化合物^[1]．对卵巢癌,转移性乳腺癌和恶性黑色寮瘤等患者疗效显著^[2],全世界红豆杉属植物有近11种,都含紫杉醇成分．但含量很低,加之现存数量很少,生长极为缓慢．造成了紫杉醇原料供应的危机^[3]。紫杉醇化学合成已经成功^[4-6],但繁杂的反应过程及前体化合物来源的限制使得它们无法实现商业化生产。最近从短叶红豆杉中分离出一种生产紫杉醇的内寄生真菌Tgromyer andreanae^[7]．由于紫杉醇含量仅为24～50ng/L．没有实用价值。植物细胞和组织培养可能是解决天然抗肿瘤药物长期供应的有效方法之一^[8]。自1991年Christen等人申请利用红豆杉细胞培养物生产紫杉醇专利以来^[9]．有关红豆杉细胞培养的研究已有不少报^[10-12]。但云南红豆杉(T.yunnanensis)仅见愈伤组织诱导的报道^[13]。本文报道云南红豆杉愈伤组织诱导和细胞培养的初步结果,并分析了细胞培养物中紫杉醇含量。     

利用 ORF438 启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白

链霉菌中表达了透明颤菌血红蛋白（VHb）,表明VHb对放线紫素的产生和菌体的生长有促进作用^[2].pIJ702质粒上带有与次生代谢有关的酪氨酸酶基因（mel）^[3],mel由ORF438启动子（P_ORF438）带动转录^[4].本文尝试利用P_ORF4328表达vgb.     

自絮凝酵母SPSC01在组合反应器系统中酒精连续发酵的研究

建立了一套由四级磁力搅拌发酵罐串联组成、总有效容积4000mL的小型组合生物反应器系统 ,其中一级罐作为种子培养罐。以脱胚脱皮玉米粉双酶法制备的糖化液为种子培养基和发酵底物 ,进行了自絮凝颗粒酵母酒精连续发酵的研究。种子罐培养基还原糖浓度为100g L ,添加 (NH₄)₂HPO₄ 和KH₂PO₄ 各 20g L ,以0.017h^-1 的恒定稀释速率流加 ,并溢流至后续酒精发酵系统。发酵底物初始还原糖浓度 220g/L ,添加 (NH₄)₂HPO₄ 15g/L和KH₂PO₄2 5g/L ,流加至第一级发酵罐 ,稀释速率分别为 0.017、0.025、0.033、0.040和0.05 0h^-1。实验数据表明 ,自絮凝颗粒酵母在各发酵罐中呈部分固定化状态 ,在稀释速率0.040h^-1 条件下 ,发酵系统呈一定的振荡行为 ,其他四个稀释速率实验组均能够达拟稳态。当稀释速率不超过 0 0 33h^-1 ,流出末级发酵罐的发酵液中酒精浓度可以达到 12 % (V/V)以上 ,残还原糖和残总糖分别在 0 11%和 0 35 % h^-1,流出末级发酵罐的发酵液中酒精浓度可以达到12%（V/V）以上,残还原糖和残总糖分别在0.11%和0.35%（W/V）以下。在稀释速率为0.033h^-1时,计算发酵系统酒精的设备生产强度指标为3.32（g·L^-1·h^-1）,与游离酵母细胞传统酒精发酵工艺相比,增加约1倍。     

原生质体融合技术构建糖化型啤酒酵母的研究

融合亲株B_6-5（Ala^-,Cys^-α）和T_3-4（His,Thr^-α）细胞于35％PEG（6000）－50mmol／LCaCl₂溶液,28℃下诱导融合30min,筛选出融合株,融合频率为6．2×10^-5。融合株细胞的体积和DNA含量均为两系株细胞之和。融合株有水解淀粉的能力,又有发酵度高于生产用酵母的特点。     

摇瓶的体积氧传递系数和氧通透率的测定

通过设计特殊摇瓶,用亚硫酸钠法测出摇瓶的体积氧传递系数和氧透过纱布层的通透率。以氧电极测其内外氧的分压降后,可以算出摇瓶表观体积氧传递系数(k_La)app及真实体积氧传递系数k_La,并进一步求出氧通透率。由实验得出：氧分压降低6．1％,氧传递系数增加一倍;在37c、220r／min、500m1摇瓶(内盛液50m1)8层纱布的氧通透率Pm=43．7moI／m²·h·arm;并且关联出摇瓶容积V、装液量VL、转速n、摄氏温度t之间的模型式：(k_La)_app=1．84×10^-7[t]1.8479·[n]2.3906.(VLV]-0.6360(kLa)=2．02×10^-7[t]1.8525·[n]2.39441·[VLV]-0.6370     

陶瓷载体固定化酵母发酵动力学研究

固定化细胞和固定化酶一样,作为固液两相的非均相催化反应系统,其反应速度无疑受到内外扩散的影响。世界各国的化学工程学者在固定化酶反应动力学方面研究得较多,固定化细胞反应动力学研究虽有些报道,但主要集中在以海藻酸钙为载体的固定化系统,且载体形状为球形颗粒。对于其他材料的不同形状颗粒载体的固定化细胞动力学研究报道较少。陶瓷作为固定化细胞载体是我们研究的一种固定化细胞的新型载体,在机械强度,孔径大小,细胞与之结合牢固度及其稳定活性,再生性能方面有其特有的优越性^[10]。为了给在生产实践中使用这种新型载体提供理论依据,本文采用球型陶瓷和拉西环陶瓷为载体固定化酵母,对它们的发酵动力学进行了比较研究。     

马利亚霉菌(Mariannaeasp.) HJ合成金属硒化物及机理研究

[背景] 金属硒化物因其优异的光电和催化特性,近年来在半导体、电化学及抗癌等领域成为了研究热点。相较于传统的化学还原法,生物合成金属硒化物具有环境友好、耗能较低等优势。然而,目前有关生物合成金属硒化合物的微生物资源较少且相关合成机理尚不明晰。[目的] 利用马利亚霉菌（Mariannaea sp.） HJ合成了3种金属硒化物并对其合成机理进行了初步探索。[方法] 利用X射线衍射（X-Ray Diffraction,XRD）和傅里叶转换红外线光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR）对菌株HJ合成的金属硒化物进行了初步的表征,考察了纳米材料合成过程中总巯基含量、总抗氧化性能及自由基含量变化,并且验证了转运蛋白DMT1在金属硒化物合成中所起的关键性作用。[结果] XRD结果表明菌株HJ能够在Bi³⁺、Pb²⁺、Co²⁺与SeO₃^2-作用下分别合成Bi₄Se₃、PbSe和CoSe₂纳米颗粒,其合成的最优pH条件分别为6.0、7.0、8.0。FTIR结果表明,合成的金属硒化物表面含有氨基、羧基、羟基等官能团。3种金属硒化物的合成反应体系与空白对照组相比,总巯基含量明显下降,而总抗氧化性能却有所提高,这表明巯基等酶促体系或氨基酸金属蛋白类的非酶促体系可能参与了SeO₃^2-的还原过程。苄基异硫脲盐酸盐屏蔽实验表明,转运蛋白DMT1在SeO₃^2-转运和金属硒化物分泌过程中起到关键作用。此外,Bi³⁺、Pb²⁺和Co²⁺的加入使得菌株HJ产生氧化应激反应,在胞外分泌了大量的过氧化氢、羟基自由基和超氧自由基,而上述自由基可通过诱导热激效应的方式增强金属离子或纳米颗粒的转运过程。[结论] 利用马利亚霉菌（Mariannaeasp.） HJ合成了Bi₄Se₃、PbSe和CoSe₂纳米颗粒,为研究金属硒化物的生物合成及机理提供了一定的理论参考。     

腺相关病毒载体工程毒株精细化纯化

[背景] 大量制备高纯度的重组腺相关病毒（Recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV）,是以腺相关病毒（AAV）为投递载体的基因靶向治疗或基因工程药物研发过程中需要解决的重要问题。[目的] 利用层析柱法大量纯化质粒和rAAV细胞培养液,以获得高纯度的rAAV颗粒。[方法] 对组装rAAV的3种质粒用HiPrep^TM10 Sepharose 6FF和HiTrap PlasmidSelect Xtra凝胶层析柱纯化,目的是得到组装AAV的超螺旋质粒DNA,然后对组装rAAV过程中的AAV-293细胞培养方法进行优化,组装成功病毒后,再对收集到的细胞提取液用HiLoad^TM10Q和HiLoad^TM10SP阴阳离子交换层析柱纯化,最后用纯化浓缩后的rAAV感染HT1080细胞,通过流式细胞仪检测荧光表达细胞数,计算浓缩后活病毒感染滴度。[结果] HiPrep和HiTrap层析柱纯化后得到大量高纯度的超螺旋质粒DNA,组装病毒后,用HiLoad柱纯化获得大量高纯度的rAAV颗粒,通过测定,rAAV基因组滴度达到（2.46±0.37）×10¹² TCID₅₀/mL （MOI=1.0×10⁴）。[结论] 通过一系列精细化组装纯化制备出高纯度、高滴度rAAV病毒颗粒。     

一种简单、快速制备与转化大肠杆菌受体细胞的方法

用TSB溶液取代常规的CaCl₂溶液,制备大肠杆菌受体细胞。在菌体处于对数早期时离心收集细胞,用TSB缓冲液悬浮后,即可用于质粒DNA的转化。转化效率可达10⁷～10⁸转化子／μgDNA。     

耐热酵母与酿酒酵母原生质体融合的研究

酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)396是利用甘蔗糖蜜生产酒精的生产菌株,假丝酵母(Candida sp·)C₆是我们从云南温泉底泥中筛选到的一株能在45℃生长良好的耐热酵母,我们应用原生质体融合技术进行了两菌株属间融合的研究。通过亚硝基胍(NTG)诱变得到的营养缺陷型菌株396(arg^－)和C6(lys^-),其融合频率为O．91×10^-5。从检出的融合子中挑选6株进行考核、其细胞体积平均为亲株的1．3倍,DNA含量平均为亲株的1．6倍,培养特征、形态、大小和生理生化特征表现不一,特别是糖类的同化试验。除F₂、F₁₄外,其他4株可以排除异核体形成的可能性。比较了在28℃,40℃和45℃培养条件下出发亲株396、C₆、直接亲株396(arg^-)C₆(lys^-)和融合子F₁、F₇、F₁₂,F₁₃的生长曲线、基质利用率和乙醇产率等,得到一株在40℃培养条件下糖的利用率为94．3％、乙醇产量为59．7g／L的属间融合株F₁₃。     

新的热带假丝酵母载体-宿主系统的建立

热带假丝酵母(Candida tropicalis)是一种可以利用多种非糖碳源代谢的微生物,在石油发酵、石油化工生产领域已得到长期应用^[1]。随着分子生物学研究技术的发展。通过代谢工程技术改变热带假丝酵母的代谢途径和流向．发展出能够把石油中的烃类物质发酵转化成各种重要化工原料、中间体的新型生产菌株,已普遍受到国内外研究机构的重视。另一方面,热带假丝酵母具有细胞生长密度高,分泌蛋白能力强等特点,可以发展成一个重要的异源蛋白表达体系。建立稳定高效的热带假丝酵母载体一宿主系统是实现上述构想的前提和关键。迄今为止,在热带假丝酵母细胞内尚未发现能游离于染色体外自主复制的天然质粒存在。目前已有20余种热带假丝酵母基因被克隆和鉴定。大部分与热带假丝酵母的氧化代谢过程有关,其中5个过氧物酶体蛋白基因的结构和2个细胞色素P450系统基因的表达调控规律巳被阐明^[2-5],与DNA复制过程有关的基因或功能序列均未见报道。本文研究和探索Candida属其他微生物基因元件在热带假酵母中的功能作用,选用热带假丝酵母细胞色素P450单加氧酶基因的启动子和侧翼调控序列^[3],构建了一套新的热带假丝酵母载体一宿主系统,并成功地表达了小鼠CYPlAl基因。     

GM3抑制人白血病J6－2细胞肌醇磷脂代谢循环

采用无载体 ³²P和[ ³H]肌醇标记磷脂,观察了促分化剂神经节苷脂GM₃对人单核样白血病J6-2细胞肌醇磷脂代谢的影响.GM₃抑制[ ³²P]Pi和[ ³H]肌醇掺入J6-2细胞磷脂酰肌醇(PI),促进[ ³²P]Pi和[ ³H]肌醇掺入磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP₂),抑制[ ³²P]Pi掺入磷脂酸(PA),抑制[ ³H]肌醇掺入三磷酸肌醇(IP₃).GM₃的上述作用均为浓度依赖性的,随GM₃浓度的提高而增强.上述结果表明,GM₃抑制J6-2细胞的肌醇磷脂代谢循环.