大肠杆菌-链霉菌穿梭表达载体pMF的构建及其应用

【目的】构建能定点整合到链霉菌(Streptomyces)染色体上的高效表达载体。【方法】以链霉菌自杀型表达载体pLSB2为基础,通过插入链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因int和attP位点(Phage attachment site),构建了能在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移并定点整合到链霉菌染色体上的表达载体pMF。将pMF转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),并分别接合转移天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorM145)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK24)和红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea2338),挑取接合子进行PCR和Southern杂交检测。将来自刺糖多孢菌S08-4的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAM-s)克隆到载体pMF的启动子下游,接合转移到天蓝色链霉菌中。【结果】表明pMF成功整入链霉菌染色体,并且检测到目的蛋白的表达。【结论】构建的pMF载体可作为外源基因定点整合表达的有效工具,为后续的基因功能研究以及链霉菌的遗传改造奠定了基础。     

Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus遗传转化体系的建立与优化

【目的】建立并优化链霉菌Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus的遗传转化系统。【方法】以整合型质粒pSET152为出发质粒,通过供体菌E.coli ET12567/pUZ8002与受体菌Streptomyces pulveraceus进行接合转移。【结果】确定了链霉菌Streptomyces pulveraceus的最佳接合转移条件:培养基为终浓度含15%甘氨酸的MS培养基;孢子热激条件为50°C 10 min;阿伯拉霉素覆盖的时间为18 h,终浓度为20 mg/L。同时,把组成型启动子ermE+与绿色荧光蛋白基因(gfp)克隆到pSET152载体上,通过接合转移整合到该链霉菌中,gfp获得表达。【结论】建立Fostriecin产生菌的遗传转化系统,并发现甘氨酸能显著提高链霉菌的接合转移效率。     

链霉菌11371基因工程宿主菌的确定

为消除链霉菌11371内源性质粒对pIJ702的限制,以提高pIJ702转化率,确定11371基因工程宿主菌。采用种内接合转移的方法对链霉菌11371衍生菌U3和P2、P5、P7进行内源性质粒的消除。获得接合转移子U3-P7-6,具有转化外源质粒的能力,转化率为17～20个/100个菌,为链霉菌11371转化体系构建、克隆基因结构、功能鉴定和基因定位等研究提供生物材料。     

浅黄根须腹菌磷酸盐转运蛋白基因异源表达分析

为探究外生菌根真菌对油松磷吸收作用的分子机理,以油松优良乡土外生菌根真菌——浅黄根须腹菌Rhizopogon luteolus的磷酸盐转运蛋白基因（RlPT）为对象,在缺陷酵母MB192中进行了异源表达研究。结果显示,该cDNA编码的蛋白质能够互补高亲和力磷酸盐转运蛋白pho84的功能;由不同pH条件下生长试验可知,该蛋白是一个与质子相偶联的运输蛋白;RlPT测算的K_m值为57.90μmol/L磷酸盐;通过酸性磷酸酶的活性检测,进一步验证该基因是具有高亲和力磷酸盐转运蛋白功能的基因。激光共聚焦显微观察表明,该蛋白在低磷条件下多定位于酵母细胞膜上发挥其功能。     

无机盐对阿维链霉菌接合转移及异源表达放线紫红素的影响

摘要：【目的】阿维链霉菌可作为异源表达抗生素生物合成基因簇的良好宿主,但是需要优化含有大片段DNA质粒的接合转移效率。【方法】我们选取MgCl2、NaCl、Ca(NO3)2 和CaCl2等4种无机盐,在0－200 mmol/L浓度范围内分别研究其对大质粒向阿维链霉菌接合转移的影响,再设计完全随机试验筛选最佳条件。【结果】CaCl2对阿维链霉菌接合转移有极明显的促进作用,MgCl2也有一定提高作用。通过完全随机试验筛选出最佳的CaCl2和MgCl2浓度组合,使大质粒的接合转移效率提高11倍。同时,本研究还发现阿维链霉菌异源表达放线紫红素的最适培养基,成功表达放线紫红素。【结论】特定无机盐对阿维链霉菌接合转移效率有明显提高作用,并且能促进放线紫红素在阿维链霉菌中的表达。     

植物中铵转运蛋白的研究进展

铵转运蛋白在众多生物中被克隆与鉴定,它是一种广泛存在于微生物、植物细胞及动物的细胞膜上主动转运铵离子的载体,分子量约为48kD,含有10～11个跨膜域.本文阐述了植物铵转运蛋白分离鉴定的过程,对于铵转运蛋白的结构、功能、基因表达调控等方面作了较详细叙述.不同氮素条件下,铵转运蛋白基因通过转录调控表现了对铵离子吸收转运的不同特点,使植物根系在较宽的浓度范围中吸收铵离子,为细胞内铵离子库的内稳态提供了理论依据.铵转运蛋白有助于作物更有效的吸收氮素,为农业生产粮食增收提供了有利保障.     

海洋链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023来源多功能几丁质酶的克隆、表达及鉴定(英文)

碳水化合物水解酶家族在自然界碳素循环及农业废弃物中几丁质、纤维素等碳水化合物的生物质转化利用中发挥了重要作用。通过PCR技术从海洋链霉菌Streptomyces olivaceus strain FXJ 7.023的fosmid基因组文库中成功克隆得到1个全长885bp的编码295个氨基酸残基的包含1个19个氨基酸残基的N-末端信号肽的壳聚糖酶完全编码区。系统进化分析表明该基因编码蛋白与已报道的Streptomyces sp.SirexAA-E来源壳聚糖酶csnA同源性为71%,与Streptomyces coelicolor A3(2)来源的csn46A同源性为70%。将该编码区重组入原核表达质粒载体pET32a并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plysS,添加IPTG在18℃条件下振荡诱导该蛋白表达,Ni2+-NTA亲和纯化获得分子量为50.3 kDa融合表达蛋白TrxA-SoCsn。该融合重组蛋白在最适反应条件下对底物胶体壳聚糖和羧甲基纤维素的最大酶活分别为3.673U/mg和1.302U/mg,最适反应温度分别为37℃和50℃,最适反应pH分别为pH5.0和pH6.0。TrxA-SoCsn相关的研究结果表明该酶在农业废弃物生物质转化等方面具有一定的应用潜力。     

亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物合成的影响

【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pep A)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株,并鉴定该基因对刺糖多孢菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响,探究该基因调控多杀菌素合成的可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pep A基因同源片段,经酶切连接技术构建敲除载体p OJ260-pep A;通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中,获得工程菌株S.sp-△pep A;利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】工程菌株S.sp-△pep A菌丝片段化程度加剧,生长态势被延缓且生物量降低,但有效促进了多杀菌素的生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变,找到表达水平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶,核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响;醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成,而辅酶A是合成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中,pep A基因作为负调控因子发挥作用。     

多烯类抗生素合成基因簇中ABC转运蛋白研究进展

ABC转运蛋白家族是一个广泛存在于不同生物细胞中且功能保守的膜蛋白亚家族;它们是一类单向底物转运泵,通常以主动转运方式完成多种分子的跨膜转运。随着抗生素合成基因簇相关研究的开展,越来越多的簇内ABC转运蛋白被鉴定出来,对其生物学功能的研究正逐渐成为热点。多烯类抗生素作为一类重要的抗真菌药物,能够有效避免真菌产生耐药性,具有非常重要的临床价值。本文以多烯类抗生素合成基因簇为对象,综述了在其中所发现的ABC转运蛋白的研究进展,综合分析了其结构特性与功能间的关系,并对研究应用进行了展望。     

糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM的构建

对糖多孢红霉菌染色体上红霉素生物合成基因进行改造 ,已经合成了多种红霉素类似物。在糖多孢红霉菌中对红霉素类似物进行结构修饰 ,以pWOR1 0 9质粒为基础构建糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM。pZM载体带有PermE启动子、fd终止子、多克隆位点、硫链丝菌肽和氨苄青霉素抗性基因、以及在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中复制的ColE1ori和pJV1ori复制子 ,系可在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中扩增的穿梭质粒。在糖多孢红霉菌中 ,pZM可以表达氨普霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因 ,从糖多孢红霉菌中提取的表达质粒酶切图谱与转化前一致 ,表明pZM是糖多孢红霉菌中多拷贝、稳定的表达载体。     

链霉菌酪氨酸酶基因的克隆与表达

本文综述了近年来对链霉菌酪氨酸酶基因的研究。由酪氨酸酶合成黑色素是链霉菌属各个种的共同特性,并受到酪氨酸酶基因的控制。链霉菌几个种的酪氨酸酶基因已克隆到,其产黑色素的特性使之作为重要的标记基因得以广泛应用,同时,该基因在链霉菌的不同种及不同属的微生物中得到了高水平的表达。链霉菌酪氨酸酶基因表达调控的分子机制也得到较深入的研究。     

链霉菌zxy19木聚糖酶酶学性质及酶基因克隆

采用平板筛选法,从红树林放线菌中筛选到一株有较强木聚糖酶活的菌株zxy19,其16SrDNA序列与Streptomyces sampsonii的同源性仅为96%.该菌株木聚糖酶活为852.41 IU/mL,酶反应最适pH值为7,最适反应温度为60℃.用针对木聚糖酶基因保守结构域的一对简并引物扩增到该酶基因部分序列,进而通过反向PCR扩增到了完整的酶基因,对该基因序列分析结果表明此木聚糖酶基因属于糖基水解酶家族11的成员,酶蛋白氨基酸序列与已报道序列同源性最高为79%(Streptomyces lividans xylanase B).构建了该酶重组表达质粒pET-28a-xyl 696,经过IPTG诱导实现了该酶蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达,且通过镍柱纯化后的表达产物具有生物学活性.     

刺山柑70 kD热休克蛋白基因克隆及原核表达

以干旱区特有的抗逆性植物刺山柑为材料,利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法,克隆了一个HSP70基因,将该基因进行原核表达,通过对大肠杆菌进行温度胁迫实验,并计算存活率来验证该基因对细胞的保护作用.结果表明:该基因全长2 202 bp,开放阅读框共1 950 bp,编码649个氨基酸,表达产物分子量为71.044 6 kD;序列分析表明,该基因属于HSP70基因家族,将该基因命名为CsHSP70,并提交到GenBank,登录号为EU574936.构建了CsHSP70基因的原核表达载体,并使重组质粒pGEX-4T-2-CsHSP70在大肠杆菌中异源表达,对大肠杆菌进行温度胁迫实验结果显示,在高温(50℃)和低温(4℃)条件下,转重组质粒的大肠杆菌在两种胁迫下存活率均高于对照,说明在温度胁迫下CsHSP70对大肠杆菌细胞具有保护作用.     

毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在链霉菌中的表达研究

应用两种链霉菌新型信号肽--vsi和gpp在常用工程菌变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）中进行了CTLA-4的分泌表达研究,vsi信号肽与CTLA-4的融合片段克隆至链霉素-大肠杆菌穿梭质粒pUWL-219,同时gpp信号肽与CTLA-4片段在质粒pLNSP中融合,分别转化S.lividans TK24,获得重组菌株S.lividans[pUWL219-VC]和S.lividans[pLNSP/CTLA-4]。重组菌株的发酵上清液经SDS-PAGE及Western blotting分析结果表明：应用不同信号肽构建的两株工程菌均能表达分子量为13000重组蛋白,具有免疫活性。     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物(GSP-1,GSP-2,GSP-3)分别与11个简并引物(AD1-AD11)配对,进行热不对称嵌套PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG,在真空条件下通过农杆菌介导,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织,Gus瞬时表达染色结果显示,该DNA片段具有种子特异的启动子活性?对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

Cloning of a DNA fragment involved in pigment production in Streptomyces avermitilis

Streptomyces avermitilis has the ability to synthesize a diffusible, brown, melanin-like pigment, a common property among many Streptomyces species. A region of the S. avermitilis chromosome involved in the production of this pigment was cloned in Escherichia coli. Production of the brown pigment was attained in E. coli, and is optimal when medium is supplemented with copper ions, tyrosine and IPTG. The cloned S. avermitilis pigment-producing DNA fragment is under the control of the lac promoter carried in the E. coli vector. The gene involved in pigment production could be used as a tool to analyse gene expression in S. avermitilis, and as an alternative cloning marker in Streptomyces-Escherichia coli vectors.     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。     

刺糖多孢菌电转化条件研究

以经理化诱变选育的多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)CB11为受体菌,将具有安普霉素(apramycin)抗性标记的整合型载体pSET152作为质粒供体,研究了制备刺糖多孢菌感受态细胞时菌体的生长阶段、质粒DNA浓度、电场强度等因素对电转化效率的影响,结果表明,在菌体培养4...     

红霉素链霉菌聚酮合成酶基因eryAIII的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryAIII基因。方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryAIII及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:NdeⅠ、HindⅢ分别酶切质粒pET-m28a/eryAIII-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryAIII编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加。结论:GroELS提高了eryAIII编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础。     

青霉菌聚半乳糖醛酸酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

筛选得到一株能分解果胶的青霉菌(Penicillium sp.),使用简并引物PCR和TAIL-PCR方法从该菌中克隆了一个聚半乳糖醛酸酶基因pgp1.pgp1基因全长1 225 bp,包含2个内含子,其cDNA全长1 104 bp,编码367个氨基酸和一个终止密码子,前18个氨基酸为信号肽序列.将pgp1基因连接pPIC9载体,在巴斯德毕赤酵母表达系统中进行了异源表达.在3L发酵罐水平,培养基中聚半乳糖醛酸酶活力达到700 U/mL.酶学性质测定表明,重组酶蛋白PGP1的最适pH为5.0,在pH4.0 -6.0下处理1h后,剩余酶活力超过90％;最适温度为38℃,以聚半乳糖醛酸为底物,PGP1的Km=(1.172±0.169)mg/mL,Vmax=(0.061±0.002) mg/min/mL.