大肠埃希菌生物被膜体外模型的建立及黄连水提物对其抑制作用的初步研究

建立大肠埃希菌生物被膜（biofilm,BF）在Ф30培养皿和96孔板表面形成的体外模型,并开展黄连水煎液对BF抑制作用的初步研究。选取临床分离的大肠埃希菌菌株,在Ф30培养皿中采用LB（Luria-Bertani medium）培养基系统复制体外BF模型,经银染后利用显微摄影系统观察BF形态;在96孔板中采用LB培养基系统复制体外BF模型,采用MTT法利用酶标仪测定OD值。将黄连水煎液作用于大肠埃希菌生物被膜体外模型,分别采用MTT法和银染法考察黄连水提物对大肠埃希菌生物被膜的影响。Ф30培养皿表面可以观察到黑染呈棉絮状的膜样物而空白组没有此样物质;96孔板中,模型组的OD值为4．191,空白组的OD值为0．069;药物作用24h后黄连组的BF明显少于空白对照组;80mg／mL的黄连水煎液即开始对大肠埃希菌生物被膜有抑制作用,抑制率为20．8％,生药浓度达到180mg／mL时为最佳抑制浓度,抑制率为70．23％。Ф30培养皿和96孔板表面可以形成大肠埃希菌生物被膜,黄连水煎液可以抑制和破坏早期及成熟BF,且其抑制作用表现出了一定的量效关系,此方法对黄连水煎液作用于大肠埃希菌生物被膜是可行且稳定的,为应用于临床试验奠定基础。     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

失重对细菌的影响及机制研究进展

失重是主要空间环境因素之一,人体及航天器会携带细菌到太空。失重会造成沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等表型改变,出现增殖、毒力、生物被膜和环境抵抗力等方面的改变。而且,失重会引起人体免疫力下降,被细菌感染机会增加。文章就失重对细菌的影响及机制进行综述,以期能为相关研究提供新思路。     

根除细菌生物被膜的新视角：分散

细菌生物被膜(biofilm,BF)是细菌为对抗外界压力形成的一种自我保护结构,对于抗菌药物具有极高的耐受性,在临床上极易引发难治性慢性感染。BF分散是指在BF形成周期中,膜内细胞主动逸出,恢复浮游生长模式,寻找新定植位点的过程。由于细菌在浮游状态下,更易受到抗菌药与免疫反应的作用,诱导BF分散是控制BF相关感染(biofilm-associated infections, BAI)的一条富有前景的策略。本文从BF分散的方式和信号分子等角度,对BF分散的调控机制进行分析;归纳能影响BF分散的物质,并对BF分散后可能带来的危害及未来的研究思路进行简述,以期为研发新型分散剂和深入研究药物作用的靶点提供理论参考。     

白花丹素对E.coli藻酸盐合成的抑制作用

细菌分泌的胞外多糖在生物被膜的形成和发展过程中发挥着重要作用。通过测定白花丹素对大肠埃希菌10389菌株(E.coli 10389)藻酸盐合成的影响及其对rse A和rpo E基因表达量的影响,探讨白花丹素对大肠埃希菌生物被膜(biofilm,BF)形成的抑制作用及机制。研究结果显示,白花丹素能抑制E.coli 10389生物被膜的形成,其抑杀E.coli 10389的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)分别为16和64μg/mL。白花丹素对成熟BF内的细菌也有抑制和杀灭作用,其抑杀E.coli 10389成熟BF内细菌的MIC和MBC分别为64和128μg/mL。白花丹素能够抑制E.coli 10389藻酸盐的合成,其中1/2MIC的白花丹素作用E.coli 10389 24 h后,与对照组比,藻酸盐的合成量降低了34.83%(P0.01)。白花丹素可显著影响E.coli 10389 rse A和rpo E基因的相对表达量,其中1/2MIC的白花丹素作用E.coli 10389 24 h后,与对照组相比,rse A的表达量上调了17.43%,rpo E的表达量降低了12.8%(P0.05)。结果表明,白花丹素能够抑制E.coli 10389 BF的形成,其作用机制可通过影响rse A和rpo E的基因表达量,进而抑制藻酸盐的合成来抑制大肠埃希菌生物被膜的形成。     

c-di-AMP调控细菌生物被膜的形成

细菌生物被膜是细菌持续性致病的重要机制。研究细菌生物被膜的形成和发展可为顽固性细菌感染防治提供新的思路与策略。环二腺苷酸c-di-AMP(Cyclic diadenosine monophosphate)是继c-di-GMP之后在细菌中新发现的一种核苷酸第二信使分子。研究发现,c-di-AMP参与调节细菌多种生理功能,包括细菌生长代谢、生物被膜形成、细胞壁的合成以及细菌毒力因子等。本文综述了c-di-AMP参与调控细菌生物被膜形成的不同方式及其分子机制。鉴于c-di-AMP在调控细菌生物被膜中的重要性,其可作为抗细菌生物被膜感染新药研发的潜在靶点。     

细菌生物被膜的耐药机制及控制策略

在特定的条件下,细菌可以形成生物被膜,包被有生物被膜的细菌称为被膜菌.被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著的不同,尤其对抗生素和宿主免疫系统具有很强的抵抗力,从而导致严重的临床问题,引起许多慢性和难治性感染疾病的反复发作.细菌生物被膜粘附在各种医疗器械及导管上极难清除,以至引发大量的医源性感染.近年来,随着人们对细菌致病机制认识的逐步深入,控制细菌生物被膜的方法已有较大发展.本文拟探讨被膜菌的耐药机制并着重综述细菌生物被膜控制方法的最新研究进展.     

铜绿假单胞菌铁摄取与生物被膜形成研究进展

生物被膜是单细胞微生物通过其分泌的胞外多聚基质粘附于介质表面并将其自身包绕其中而成的膜样微生物细胞聚集物。生物被膜的形成使细菌具有更强的适应外界环境的能力,也是导致微生物产生耐药性及慢性感染性疾病难以治疗的重要原因之一。铜绿假单胞菌在肺部的定殖是肺囊性纤维化病患者发病和死亡主要原因,其造成的感染通常与形成抗生素抗性极强的生物被膜有关。铜绿假单胞菌生物被膜的形成受控于多种复杂的细菌调控体系之下,包括群体感应系统及参与调节胞外多聚基质合成的双组分调控系统等。此外,为了利用低浓度的环境铁来维持生存并完成各种生理功能,铜绿假单胞菌进化出了一系列铁摄取系统,这些系统对其毒力因子的释放和生物被膜的形成又起着重要的调控作用。本文主要对铜绿假单胞菌生物被膜的形成与调控机制及其铁摄取系统进行了综述,为进一步了解及清除铜绿假单胞菌引发的问题提供途径与思路。     

葡萄球菌生物被膜的基因调控机制研究进展

摘要:细菌的耐药性问题是目前医学临床面临的严峻问题,其中细菌生物被膜的形成是引起细菌持续性感染的主要致病机制之一。细菌生物被膜的形成过程十分复杂,受多种因子和多基因的共同调控,且不同的因子和基因在生物被膜形成的不同阶段所起的作用不同。本文重点对引起院内感染的主要致病菌葡萄球菌的生物被膜形成的基因调控机制,以及药物抑制葡萄球菌生物被膜的研究现状进行综述,旨在为解决医学临床中存在的细菌感染,研制抗生物被膜药物和疫苗等提供参考。     

铜绿假单胞菌生物被膜组成及其受群体感应系统和c-di-GMP调控的研究进展

作为人类条件性感染的前三大病原菌之一的铜绿假单胞菌,是一种革兰氏阴性细菌,对免疫功能低下和囊性纤维化患者可以造成严重和持续性感染。造成这种持续感染的原因主要是由于细菌接收外界信号后,在自身调控网络的协同作用下,会依附于固体表面,并产生胞外多糖、基质蛋白和胞外DNA等大分子物质形成高度结构化的膜状复合物将自身包裹形成生物被膜群体结构。生物被膜可以有效帮助细菌定殖、提高细菌对抗菌物质和宿主免疫反应的抵抗能力、促进群落细菌的细胞-细胞之间的信号交流等,是临床治疗中病原菌慢性感染和反复感染最重要的原因之一。本篇综述重点介绍了铜绿假单胞菌生物被膜的各组成成分及其在生物被膜形成中的重要功能,并进一步阐述了群体感应系统(las、rhl、pqs与iqs)和c-di-GMP对铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控作用。通过本篇综述可以更清晰地了解细菌生物被膜形成和调控的过程,为开发新的治疗生物被膜感染策略提供帮助。     

肠外致病性大肠杆菌致病机制及公共卫生学意义

致病性大肠杆菌包括肠致病性大肠杆菌(intestinal pathogenic Escherichia coli, IPEC)和肠外致病性大肠杆菌(extraintestinalpathogenicE.coli,ExPEC),可引起人和动物多种感染性疾病。ExPEC主要在肠道外其他组织脏器定殖并导致感染,包括尿道致病性大肠杆菌(uropathogenicE.coli, UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(newborn meningitis E. coli, NMEC)和禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic E. coli, APEC)。人源ExPEC (UPEC和NMEC)主要引起人尿道感染、肾盂肾炎和新生儿脑膜炎,而APEC可导致禽类的大肠杆菌病,造成家禽业的巨大经济损失。另外,乳腺致病性大肠杆菌(mammary pathogenic E. coli, MPEC)和猪源ExPEC可导致奶牛乳房炎、猪的肺炎及急性败血症等病症。研究发现,ExPEC类菌株在基因组结构上很相似,与IPEC本质区别在于致病机制不同,ExPEC具有很多相同的毒力基因和耐药基因,而且动物源ExPEC...     

大肠杆菌的耐酸机制及其改造研究进展

微生物细胞在自然环境或工业应用中经常受到酸胁迫,严重制约细胞生长性能和产物合成效率。为了在各种酸性环境中生存,耐酸细菌发展出多种保护机制来维持细胞内pH稳态,如氢离子消耗、细胞膜保护、代谢修饰等。因此,深入研究耐酸机制、改进菌株耐酸能力对于利用微生物发酵合成高附加值产品具有重要意义。作为模式微生物,大肠杆菌耐酸机制的研究较为透彻,近年来其耐酸性改造也取得了重大进展。本文主要总结了大肠杆菌的氧化或葡萄糖抑制系统(acid resistance system 1, AR1)、谷氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 2, AR2)、精氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 3, AR3)、赖氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 4, AR4)和鸟氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 5, AR5)、细胞膜保护以及生物大分子修复等方面的耐酸机制,并概述了利用传统代谢工程、全局转录工程和适应性实验室进化等方法构建大肠杆菌耐酸菌株的研究进展,同时展望了大肠杆菌耐酸机制及其改造的后续研究方向...     

Development of nitrilase promoter-derived inducible vectors for Streptomyces

An inducible expression vector, pSH19, which harbors regulatory expression system P_nitA-NitR, for streptomycetes was constructed previously. Here, we have modified pSH19 to obtain shuttle vectors for Streptomyces-E. coli by introducing the replication origin of a plasmid for E. coli (ColE1) and an antibiotic-resistant gene. Six inducible shuttle vectors, pESH19cF, pESH19cR, pESH19kF, pESH19kR, pESH19aF, and pESH19aR, for Streptomyces-E. coli, were successfully developed. The stability of these vectors was examined in five different E. coli strains and Streptomyces lividans TK24. The stability test showed that the pSH19-derived shuttle vectors were stable in E. coli Stbl2 and S. lividans TK24. Heterologous expression experiments involving each of the catechol 2,3-dioxygenase, nitrilase, and N-substituted formamide deformylase genes as a reporter gene showed that pESH19cF, pESH19kF, and pESH19aF possess inducible expression ability in S. lividans TK24. Thus, these vectors were found to be useful expression tools for experiments on both Gram-negative and Gram-positive bacterial genes.     

Marine hydrocarbonoclastic bacteria as whole‐cell biosensors for n‐alkanes

Whole‐cell biosensors offer potentially useful, cost‐effective systems for the in‐situ monitoring of seawater for hydrocarbons derived from accidental spills. The present work compares the performance of a biosensor system for the detection of alkanes in seawater, hosted in either Escherichia coli (commonly employed in whole‐cell biosensors but not optimized for alkane assimilation) or different marine bacteria specialized in assimilating alkanes. The sensor system was based on the Pseudomonas putida AlkS regulatory protein and the PalkB promoter fused to a gene encoding the green fluorescent protein. While the E. coli sensor provided the fastest response to pure alkanes (25‐fold induction after 2 h under the conditions used), a sensor based on Alcanivorax borkumensis was slower, requiring 3–4 h to reach similar induction values. However, the A. borkumensis sensor showed a fourfold lower detection threshold for octane (0.5 μM), and was also better at sensing the alkanes present in petrol. At petrol concentrations of 0.0125%, the A. borkumensis sensor rendered a sevenfold induction, while E. coli sensor showed no response. We discuss possible explanations to this behaviour in terms of the cellular adaptations to alkane uptake and the basal fluorescence produced by each bacterial strain, which was lowest for A. borkumensis.     

新型鸭细小病毒样颗粒的制备及鉴定

【背景】鸭短喙侏儒综合征(beak atrophy and dwarfism syndrome, BADS)是由新型鸭细小病毒(novel duck Parvovirus, NDPV)感染导致雏鸭生长发育迟缓、上下喙萎缩的疾病。BADS的暴发给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。【目的】利用大肠杆菌表达系统制备NDPV病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),为研制NDPV相关疫苗奠定基础。【方法】对NDPV VP2序列全长进行密码子优化、合成,连接至pColdTF表达载体,获得pColdTF-NDPV-VP2重组质粒,酶切、测序鉴定正确后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)对蛋白表达进行可溶性分析;使用凝血酶(thrombin)切除trigger factor (TF)标签,利用镍柱(Ni-NTA)亲和层析方法纯化重组蛋白;利用Western blotting对纯化后的VP2蛋白进行反应原性分析;利用透射电镜、动态光散射观察重组蛋白形态以及能否形成VLPs。【结果】构建了pColdTF-NDPV-VP2重组质粒,在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达,融合蛋白TF-VP2大小约为115 kDa,去除TF标签经镍柱纯化后得到67 kDa的VP2蛋白;Western blotting试验表明VP2蛋白能与NDPV鸭阳性血清发生特异性结合;通过透射电镜可以观察到形状规则、直径约为20−25 nm的病毒样颗粒。【结论】利用大肠杆菌表达系统制备了NDPV VLPs,为下一步研发BADS相关亚单位疫苗及生物相关制品提供了基础。     

Citrate utilization under anaerobic environment in Escherichia coli is under direct control of Fnr and indirect control of ArcA and Fnr via CitA-CitB system

Most Escherichia coli (E. coli) strains do not cause disease, naturally living in the lower intestine and is expelled into the environment within faecal matter. Escherichia coli can utilize citrate under anaerobic conditions but not aerobic conditions. However, the underlying regulatory mechanisms are poorly understood. In this study, we explored regulatory mechanisms of citrate fermentation genes by global regulators ArcA and Fnr under anaerobic conditions. A gel mobility shift assay showed that the regulator proteins ArcA and Fnr binded to the promoter region localized between the citAB and citCDEFXGT operons. Subsequent assays confirmed that ArcA indirectly controled the expression of citrate fermentation genes via regulating CitA-CitB system, while Fnr directly regulated but also indirectly modulated citrate fermentation genes via controling CitA-CitB system. Deletions of arcA and fnr significantly reduced the growth of Escherichia coli in M9 medium with a citrate carbon source. We conclude that both ArcA and Fnr can indirectly control the citrate utilization via CitA-CitB system, while Fnr can also directly regulate the expression of citrate fermentation genes in E. coli under anaerobic conditions.