重组枯草芽孢杆菌全细胞高效催化合成D-甘露糖

D-甘露糖是一种在食品、医疗、化妆品等领域具有很大经济价值和应用价值的天然己糖。但是目前大部分生物合成法都是以大肠杆菌作为宿主,生产过程中存在安全性问题,对后续应用产生了诸多限制。本研究通过比较多个来源的甘露糖异构酶的酶学性质,筛选出最优来源甘露糖异构酶。以食品安全级菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168为底盘细胞,将最优来源的甘露糖异构酶进行异源表达,获得了重组菌株B. subtilis 168/pMA5-EcMIaseA,用于以D-果糖为底物全细胞催化高效合成D-甘露糖。通过优化转化温度、pH、底物浓度等条件,提高其转化合成D-甘露糖的效率。结果表明,重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 168/pMA5-EcMIaseA在最适转化条件下进行5 L发酵罐全细胞转化,分别以500 g/L果糖和600 g/L果糖为底物,转化6 h后D-甘露糖的产量分别为138.74 g/L和163.30 g/L,转化率分别达到27.75%和27.22%,这是目前报道的以食品级菌株进行D-甘露糖生产的最高产量。本研究为D-甘露糖的工业化安全生产及应用奠定了重要基础。     

过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆表达及发酵优化

利用PCR扩增技术得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)过氧化氢酶基因katA,将该基因与表达载体pET-20b(+)连接构建重组质粒,经测序验证后,在大肠杆菌JM109中进行表达得到重组大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-katA).SDS-PAGE电泳结果显示出...     

基于启动子和信号肽优化提高谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

【背景】 谷氨酰胺酶(glutaminase)是一种能够催化l-谷氨酰胺水解生成l-谷氨酸和氨的酶,在食品、医药等领域有重要的应用价值。【目的】 研究不同启动子和信号肽对谷氨酰胺酶分泌表达的影响、构建能高效分泌表达谷氨酰胺酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌株,提高谷氨酰胺酶的产量。【方法】 选用枯草芽孢杆菌SCK6作为表达宿主,构建带有不同启动子和信号肽的谷氨酰胺酶表达载体及重组菌株,分析不同基因元件对谷氨酰胺酶表达及分泌的影响,筛选最优启动子和信号肽,组合优化,构建高效分泌表达谷氨酰胺酶的工程菌株。【结果】 实现了谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,在以P_HpaII-P_aprE为启动子、YndA为信号肽的条件下,摇瓶发酵胞外最高酶活达到6.7 U/mL。【结论】 通过对启动子、信号肽关键基因元件进行筛选组合,构建了一株高效分泌表达谷氨酰胺酶的菌株,为酶的高效分泌表达提供了一种有效的方法。     

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达及固定化细胞研究

将来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPEase基因在食品级表达系统Bacillus subtilis中进行产酶研究,在3L发酵罐中高密度发酵最终酶活可达495U/ml,得到高表达量的DPEase酶液。通过硅藻土-海藻酸钠(吸附包埋法)对重组细胞进行固定化研究,结果表明,当海藻酸钠浓度为2%、细胞包埋量为50g/L、CaCl_2浓度为2%、硅藻土浓度为1%时,固定化细胞酶活回收率可达64%,固定化细胞与游离细胞相比最适pH不变,最适温度提高5℃,热稳定性明显提高,连续反应7个批次后转化率仍然为28%,仍保持81%的残余酶活,具有很高的工业应用价值。     

构建整合型重组枯草芽孢杆菌高效合成胍基乙酸

胍基乙酸作为一种能源性物质,在食品、医药和饲料等行业有着广泛的应用前景,但目前尚未实现利用生物法工业化生产胍基乙酸。本研究在食品级安全菌株枯草芽孢杆菌中设计胍基乙酸的合成路线,利用调控关键酶表达、解除反馈抑制、增加膜通透性等技术,实现全细胞催化高效合成胍基乙酸。首先基于进化树挖掘筛选最佳L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶,利用强启动子与基因组整合相结合的策略提高关键酶表达水平;其次,引入谷氨酸棒杆菌中用于L-精氨酸合成的鸟氨酸循环途径,缓解副产物L-鸟氨酸对酶的反馈抑制,并敲除L-精氨酸降解途径,强化底物再生;再次,增强N-乙酰胞壁-L-丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, LytC)基因表达,改善细胞膜通透性;最后,使用菌株Bs-13在最佳转化条件下,经24 h获得13.1 g/L胍基乙酸,转化速率为0.54 g/(L·h),底物甘氨酸的转化率为92.7%。以上策略一定程度上提高了胍基乙酸的生产效率,为生物法合成胍基乙酸提供了参考。     

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。目前,枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异性及自诱导型。详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点,并对克隆新的启动子的方法做了总结,旨为完善枯草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。     

全细胞催化合成阿糖胞苷工艺的研究

以阿糖尿苷和胞嘧啶为原料,采用枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis A302作为全细胞催化剂进行阿糖胞苷的生物合成,通过单因素与正交试验的考察,得到了全细胞催化合成阿糖胞苷的最佳反应条件:反应初始pH为7.0,反应温度为36℃,催化剂添加量为250 mg,摇床转速为190 rpm,该条件得到的阿糖胞苷收率达到65.3％.该方法操作简单,反应体系杂质较少,是合成阿糖胞苷的一种有效可行的方法.     

双启动子促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中表达及发酵研究

为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子P_(HpaⅡ)之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(P_(grac)、P_(gl-M1))和4种组成型启动子(P_(43)、P_(laps)、P_(HpaⅡ)、P_(amyQ))进行构建表达,其中组成型启动子P_(amyQ)与P_(HpaⅡ)构成的双启动子效果最好,有效地将胞外活性提高到31. 24U/ml,是单启动子PHpaⅡ的3. 4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽,但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis168/pW6(P_(HpaⅡ)-P_(amyQ))进行7. 5L发酵罐补料发酵产酶研究,LeuDH酶活达到217. 96U/ml,是摇瓶水平的6. 97倍,对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。     

拮抗枯草芽孢杆菌KC-5的分离鉴定及其发酵优化

为了筛选出对植物病原菌具有拮抗作用的生物防治细菌,采用平板对峙法从蔬菜根际土壤中分离获得一株对多种病原真菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌,并对抑制后的病原菌菌丝进行了观察,结果表明该菌株对尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、层出镰刀菌以及腐皮镰刀菌均具有抑菌活性。通过形态特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并对其发酵培养基进行了优化。     

重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化

 为获得巨大芽孢杆菌青霉素 G酰化酶 (PGA)的高产菌株和条件 ,构建了分泌表达 PGA的基因工程枯草杆菌菌株 ,对表达条件进行了优化 .以 LB作为初始培养基 ,考察了温度、苯乙酸、装液量、碳源对于工程菌 PGA产量的影响 .实验发现重组细胞产酶不再需要变温和苯乙酸诱导 .充足的通气量和适当浓度的淀粉可使细胞密度及 PGA表达量大为提高 .表达条件优化后 ,菌体 A60 0由 3提高到 2 0 ,PGA的表达量由 3～ 6U/ml提高到 35～ 40 U/ml,为目前生产用巨大芽孢杆菌表达量的 6倍 .     

Crystal structure of the flavoprotein ArsH from Sinorhizobium meliloti

Purified ArsH from Sinorhizobium meliloti exhibits NADPH:FMN-dependent reduction of molecular O2 to hydrogen peroxide and catalyzes reduction of azo dyes. The structure of ArsH was determined at 1.8A resolution. ArsH crystallizes with eight molecules in the asymmetric unit forming two tetramers. Each monomer has a core domain with a central five-stranded parallel beta-sheet and two monomers interact to form a classical flavodoxin-like dimer. The N- and C-terminal extensions of ArsH are involved in interactions between subunits and tetramer formation. The structure may provide insight in how ArsH participates in arsenic detoxification.     

添加物对枯草芽胞杆菌γ-聚谷氨酸合成代谢的影响

在枯草芽孢杆菌HCUL-B115代谢网络和发酵特性研究的基础上,通过添加适量的氨基酸、有机酸和维生素对聚γ谷氨酸(γPGA)发酵进行合成代谢进行研究。结果发现,大部分添加物对聚γ谷氨酸的积累都有一定的影响,特别是L谷氨酸、L苯丙氨酸、L精氨酸、L天冬氨酸、L缬氨酸、延胡索酸、草酸、丙二酸、烟酸、维生素B6和抗坏血酸等添加物对菌株HCUL-B115合成聚γ谷氨酸有明显促进作用,添加后产率比不添加任何物质提高20%左右。从代谢层面上分析,这些添加物除了促进菌体自身生长之外,同时防止了菌体对各添加物的过量合成,强化了菌株HCUL-B115合成聚γ谷氨酸的代谢途径。     

枯草芽孢杆菌产胞苷的初步研究

目的:通过对野生型枯草芽孢杆菌NO122的诱变筛选,选育出胞苷产生菌株。方法:以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株进行紫外线、硫酸二乙酯诱变,经3-脱杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷结构类似物平板定向筛选产胞苷突变株;研究碳源、氮源、温度、初始pH值等发酵条件对该突变菌株产胞苷的影响。结果:经诱变传代后得到突变株TZM1012,该突变株在发酵温度37℃、初始pH7.2、摇床转速220r/min的条件下,摇瓶发酵72h,发酵液中的胞苷可达1.873g/L,并具有较好的遗传稳定性。结论:获得产胞苷生产菌株,并具有较好的遗传稳定性。     

高产纤维素酶枯草芽胞杆菌S-16的筛选及其发酵工艺优化

利用刚果红鉴别培养基及基础液体筛选培养基进行菌种筛选,从新疆盐碱地分离得到的16株菌株中筛选获得一株产纤维素酶活力较高的菌株S-16,对该菌株进行16SrDNA鉴定,确定该菌为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。对S-16发酵产纤维素酶的主要影响因素进行研究,分别考察了碳源、氮源、培养基初始pH和接种量等因素对发酵产纤维素酶的影响。结合单因素影响实验得到优化后的培养基配方为:羧甲基纤维素钠1.5%,酵母粉1%,NaCl 1%,MgSO_4·7H_2O 2‰,KH_2PO_4·3H_2_O 1‰。优化后的发酵条件为:初始pH为8,接种量1%,种龄8h,培养时间48h。经过发酵工艺优化,S-16产生的羧甲基纤维素酶活(CMCase)和滤纸酶活(FPase)分别达到4.64IU/mL和0.46IU/mL,与初始培养条件下的酶活相比分别提高了3.14倍和1.30倍。本研究得到的枯草芽胞杆菌S-16及其优化发酵工艺为秸秆的快速腐熟和高产纤维素酶的应用奠定了基础。     

重组枯草芽胞杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的表达并通过细胞内的葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生,以枯草芽胞杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件,将羰基还原酶基因mldh连接至构建好的质粒(pHY300plk-PrpsD-TrpsD上,得到质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD;进一步将重组质粒转化入B. subtilis Wb600中获得重组菌B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-Trps     

DNA replication in dnaB mutants of Escherichia coli: Gene product interaction and synthesis of 4 S pieces

The DNA produced by several dnaB mutants has been examined both in vivo and in vitro. The alleles chosen for study had previously been shown to differ over a wide range in the apparent severity of their effects on DNA replication.Comparison of DNA replication between dnaB heteroallelic diploids and the constituent haploid strains indicates interaction between the dnaB products in the heteroallelic diploids. The data are consistent with a functional multimeric aggregate of dnaB gene products that is at least a tetramer.Alkaline sucrose gradient profiles of pulse-labeled DNA, synthesized by some of the mutants in vivo and by mutant lysates in vitro, exhibit a peak at about 4 S. The 4 S DNA is most apparent in those mutants in which replication is most severely restricted by temperature.This 4 S material can be chased in vitro into DNA larger than Okazaki pieces, and density transfer experiments indicate that these pieces are formed at the replication fork. Conversion of the 4 S material to large DNA is not altered by inhibition of polynucleotide ligase either by the presence of the lig-4 polA1 mutations in vivo or by the addition of nicotinamide mononucleotide in vitro. The in vitro observations suggest that 4 S pieces are formed on only one side of the replication fork.     

鸟苷发酵条件的优化研究

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TA208为供试菌株,运用单因素实验方法进行了摇瓶条件下发酵培养基以及发酵条件的优化研究,在最优发酵条件下鸟苷产量达到19．79g／L,比基本培养条件提高32．37％。     

肌苷产生菌B.Subtilis H841在2升罐中的发酵

枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)H841肌苷产生菌是腺嘌呤、组氨酸、硫胺素三重缺陷型菌株,并对8—氮杂乌嘌呤、6—巯基嘌呤有抗性。在摇瓶中产肌胺18.1克/升,在2L自控发酵罐中最高可产肌苷19.6克/升,在流加葡萄糖情况下可产肌苷26.2克/升。控制pH较不控制pH发酵肌苷产量有较大的增加,控制pH发酵并补加营养时,肌苷产量可稳定地增长,但对葡萄糖的转化率是相同的。