嗜热毛壳菌纤维素酶（CBHⅡ）cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum CT2是一种土壤腐生菌,可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RACE-PCR获得嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因(cbh2)。DNA序列分析表明cbh2的开放阅读框由1428个碱基组成,编码476个氨基酸。推断的氨基酸序列包含一个典型真菌纤维素酶的糖结合域（CBD）、催化域（CD）以及二者之间富含脯氨酸和羟基氨基酸的连接桥。根据氨基酸序列推算该酶分子量为53kD,属于糖苷水解酶第六家族,具有该家族催化保守区的典型特征。PCR扩增cbh2的成熟蛋白编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶蛋白的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.2 mg/mL。经硫酸铵沉淀、DEAESepharose Fast flow阴离子层析等步骤纯化了该重组表达蛋白。SDS-PAGE得到重组蛋白分子量为67kD,与从嗜热毛壳菌中纯化的该酶分子量一致。该重组纤维二糖水解酶作用的最适合温度50℃,最适pH4.0,在70℃的半衰期为30min,具有较好的热稳定性。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

斜卧青霉A10产纤维素酶的酶学性质研究

以斜卧青霉（Penieillium decumbens）A10为出发菌株,经450Gy ^60Coγ-射线诱变处理,选育出一株具有较高纤维素酶活力且传代稳定的正突变株A50,发酵60h后,其CMC酶活和滤纸酶活分别为27．28IU／mL和1．98IU／mL,较出发菌株A10分别提高了33．2％和45．59％。对突变株A50的产酶组分进行研究,通过SDS—PAGE电泳分析,从蛋白质水平上证明突变株A50确实是A10在遗传物质上发生改变的菌株,其CMC酶活最适作用pH值为4．0,最适作用温度为60℃;而滤纸酶活的最适作用pH值为5．2,最适作用温度45℃,二者在一定范围内具有较高的稳定性。     

Secretory expression of arginine deiminase in E.coli

将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arcA克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢ B中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI.将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’后进行诱导表达,分别考察了不同诱导物L-arabinose浓度、诱导温度、诱导时间对重组蛋白表达的影响,最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002％ (w/v),25℃下诱导5h,全细胞的酶活为68 mU/mL(指单位发酵液体积,下同).采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL.SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kD.     

精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中的分泌型表达

将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arc A克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢB中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI。将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F'后进行诱导表达,分别考察了不同诱导物L-arabinose浓度、诱导温度、诱导时间对重组蛋白表达的影响,最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002%(w/v),25℃下诱导5 h,全细胞的酶活为68 mU/mL(指单位发酵液体积,下同)。采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kD。     

黑色葡萄状穗霉S607耐碱性纤维素酶发酵条件的研究

研究了耐碱性纤维素酶生产菌株黑色葡萄状穗霉S6 0 7(StachybotrysatraS6 0 7)的产酶条件。结果表明 ,S6 0 7的最适生长和产酶 pH为 7.0 ,最适产酶温度为 2 8℃ ,摇床最适转速为 180r/min。在以 2 .0 %纤维素粉和 2 .5 %的麸皮作为碳源时产酶最高 ,添加含 (NH4 ) 2 SO4 、尿素和蛋白胨的复合氮源对生长和产酶有明显的促进作用。在最适培养条件下 ,发酵周期为 4～ 5d ,发酵液中CMC酶活为 2 .12IU /mL ,FP酶活为 1.0 3IU /mL ,β 葡萄糖苷酶活为 0 .86IU /mL。     

黑曲霉GD-6纤维素酶液体发酵条件的研究

采用黑曲霉 (Aspergillusniger)GD 6液体发酵生产纤维素酶 ,研究了碳源、氮源、培养基起始 pH值、接种量、摇床转速、通气量对该菌株产纤维素酶活力的影响。结果表明 ,GD 6的最适发酵温度为 2 8～ 3 0℃ ,产酶pH为 5 .5～ 6.0 ,摇床最适转速为 1 5 0r/min ,最佳接种量为 1 0 %。在以 6.0 %稻草粉为碳源、1 %豆饼粉为氮源时产酶活力最高。在最适培养条件下 ,发酵周期为 1 2 0h,发酵液中CMC酶活为 1 88.6U/mL ,FP酶活为 2 7.0U/mL。     

拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）UV Ⅲ产纤维素酶液体发酵研究

以拟康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii)TH为出发菌株,经紫外诱变获得一抗高浓度葡萄糖阻遏突变株UV Ⅲ,其液体发酵最适产酶培养基为（W／V）：豆皮粉3％,硝酸铵0．6％,磷酸二氢钠0．65％,硫酸镁0．25％,氯化钙0．15％,pH5.0;最佳发酵条件为：30℃,125r/min。发酵7d CMCase活力可达103．55IU／mL,滤纸酶活可达5．51IU／mL,β-葡萄糖苷酶活可达0．96IU／mL,分别比出发菌株TH提高了1．40、2．34、0．60倍。     

黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因,通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主,获得最佳重组菌KM71-MAN,其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD,最适反应温度为80℃,最适pH为5.0。该酶在70℃(pH5.0)保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h(50℃)酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖,产物以甘露二糖和甘露六糖为主,甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性,在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。     

内切中性纤维素酶EGⅡ的发酵条件优化

对毕赤酵母基因工程菌EIM-50-eg2产内切中性纤维素酶的主要影响因子进行研究,考察氮源、pH、温度、微量元素PTM1和甲醇浓度等对工程菌产酶的影响。单因素实验和正交实验结果表明,优化后的培养基组成及培养条件:磷酸氢二铵40 g/L,甲醇15 mL/L,硫酸镁10 g/L,磷酸二氢钾9 g/L,初始pH 6.0,培养温度28℃,PTM1添加量0.02%,甲醇诱导浓度1.5%。优化后内切葡聚糖酶活力可达4 158 U/(mL.min)是优化前1 449 U/(mL.min)的2.86倍。     

葡枝根霉TP-02中的内切葡聚糖苷酶基因在枯草芽胞杆菌WB600中的克隆和表达

利用cDNA文库筛选的方法将葡枝根霉TP-02中的内切葡聚糖苷酶基因(eg2和eg3)在枯草芽胞杆菌WB600中成功地克隆和表达。阳性克隆在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基中发酵36 h内切葡聚糖酶活达到最大值,分别为1.174和1.034 IU/mL,相比出发菌株发酵时间缩短了54 h。用G100分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得EGⅡ和EGⅢ分子量分别为44、46 ku。     

Characterization of the endo-beta-1,3-glucanase activity of S. cerevisiae Eng2 and other members of the GH81 family

The GH81 family includes proteins with endo-beta-1,3-glucanase widely distributed in yeast and fungi, which are also present in plants and bacteria. We have studied the activity of the Saccharomyces cerevisiae ScEng2 and the Schizosaccharomyces pombe SpEng1 and SpEng2 proteins. All three proteins exclusively hydrolyzed linear beta-1,3-glucan chains. Laminari-oligosaccharide degradation revealed that the minimum substrate length that the three endoglucanases were able to efficiently degrade was a molecule with at least 5 glucose residues, suggesting that the active site of the enzymes recognized five glucose units. Prediction of the secondary structure of ScEng2 and comparison with proteins of known structure allowed the identification of a 404-amino acid region with a structure similar to the Clostridium thermocellum endoglucanase CelA. This fragment showed similar enzymatic characteristics to those of the complete protein, suggesting that it contains the catalytic domain of this family of proteins. Within this domain, four conserved Asp and Glu residues (D518, D588, E609, and E613) are necessary for enzymatic activity.     

甲醇／山梨醇共混诱导改善重组毕赤酵母表达猪a干扰素发酵过程和NADH再生效率

在10L发酵罐中利用重组毕赤酵母诱导表达猪a干扰素（pIFN-a）,考察甲醇／山梨醇共混诱导策略对pIFN-a表达水平提高和能量（NADH）再生效率的影响。结果表明：在诱导稳定期,甲醇／山梨醇共混诱导可弱化细胞的甲醇代谢,有利于缓解毒副中间产物（过氧化氢、甲醛等）的生成积累;以0．785g／（L·h）的速率缓慢共混流加山梨醇时,pIFN-a抗病毒活性最大,最高活性可达1．8×107IU／mL,与30℃常温甲醇单独诱导（最高活性1．0X10。IU／mL）和20℃低温甲醇单独诱导（最高活性1．4×lO6IU／mL）相比,活性均大幅提高,且胞外pIFN-a的降解减缓;发酵体系的抗高甲醇浓度冲击能力有效提高,发酵生产的稳定性增强;能量利用效率大幅提高,NADH的再生利用效率提高了29％-84％。     

重组青霉素G酰化酶拆分制备（S）-邻氯苯甘氨酸

对产青霉素G酰化酶的重组枯草芽胞杆菌发酵产酶条件进行优化,确定优化后的发酵条件：可溶性淀粉10g/L、蛋白胨12g/L、酵母粉3g/L、NaCl10g,／L;pH7．5、培养温度37℃、装液量80mL（500mL三角瓶）、培养28h,青霉素G酰化酶的表达水平由最初的7．34U／mL提高至18．23U／mL。以表达青霉素G酰化酶的枯草芽胞杆菌发酵液为酶源,在水相中对映选择性催化N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸制备（S）-邻氯苯甘氨酸,当底物浓度为100mol／L时转化4h,转化率达44．2％。对底物浓度为80mmoL／L反应液中的（S）-邻氯苯甘氨酸进行分离,达到理论收率的94．29％（以N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸的0．5倍摩尔量为理论产率）,e．e．值大于99．9％。170℃条件下,N-苯乙酰-（R）-邻氯苯甘氨酸与苯乙酸共熔消旋为N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸可用于循环拆分。     

中性内切型纤维素酶在毕赤酵母中高水平表达的研究

中性内切型纤维素酶在纺织及造纸工业具有重要的应用,为了进一步提高从我国草菇中克隆的一种新的中性内切型纤维素酶(EG1)在Pichiapastoris中的表达水平,我们进行了提高基因拷贝数及高密度发酵等多种手段实现其高水平表达的研究。在前期研究的基础上,利用对已整合eg1的重组子再转化的方法,从含有2000μgLZeocin的YPDSZ平板上筛选到高抗Zeocin转化子,在摇瓶培养条件下,该转化子表达量比原来提高了3.8倍,在pH4～8条件下均有稳定表达,接种量(OD600=5.0)表达水平最好,提高甲醇的诱导浓度对表达有显著的促进作用。用3.2L发酵罐进行了高密度发酵,甲醇诱导95.5h后达到最高值,比摇瓶培养再提高了6.4倍,因此利用高抗Zeocin转化子及高密度发酵的手段,使EG1的表达水平提高了34倍,蛋白表达量达8.80mgmL,EG1酶活达到543.36IUmL,实现了中性内切纤维素酶的高水平表达,本研究将大大促进建立我国纺织用纤维素酶大规模高效生产技术。     

玉米芯稀酸水解及L-乳酸发酵研究

对玉米芯稀硫酸水解条件及糖化液发酵L-乳酸进行了初步研究。结果表明,玉米芯木聚糖最适水解条件为2%H2SO_4、120℃、30 min、固液比1:10,糖化液还原糖含量可达40.8 g/L,主要成分为木塘。细菌A-19可以利用水解液中的葡萄糖和木糖产酸,最适发酵条件为45℃、pH 6.5,从45℃～51℃、pH 5.5～pH 6.5产量均较高。用未浓缩的水解液发酵24 h,L-乳酸产量为30.6g/L,残糖为1.6 g/L,糖酸转化率为82.6%;用浓缩1倍的水解液发酵48 h,L-乳酸产量为41.4 g/L,残糖4.1g/L,糖酸转化率为68.2%,在发酵48 h后继续补料发酵至72 h(补料液为浓缩3倍的水解液),L-乳酸产量为50.9 g/L,残糖6.3 g/L,糖酸转化率为71.8%。该研究为利用木质纤维素生产L-乳酸奠定了一定基础。     

腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

源于解淀粉芽胞杆菌酚酸脱羧酶的克隆与表达

【背景】酚酸脱羧酶催化分解酚酸产生的4-乙烯基酚类物质可用于食品添加剂及香精香料行业,而酚酸脱羧酶的表达水平相对较低,因此,高水平的酚酸脱羧酶是工业规模生产4-乙烯基酚类物质的先决条件。【目的】克隆解淀粉芽胞杆菌的酚酸脱羧酶基因,实现在大肠杆菌中的高效异源表达,分析酚酸脱羧酶的底物特异性,并对其表达条件进行优化。【方法】通过PCR技术获得酚酸脱羧酶的基因,构建重组基因工程菌,将测序结果与其他酚酸脱羧酶序列进行比对,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白。将重组酚酸脱羧酶与4种不同的底物进行反应,设计响应面试验对诱导条件进行优化。【结果】酚酸脱羧酶对对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸的比酶活比率为:100:23.33:15.39:10.51。结合与其他酚酸脱羧酶比对结果发现酚酸脱羧酶家族的C末端区域氨基酸序列的变异率最高,这与酚酸脱羧酶的底物特异性和催化机制有关。通过单因素和响应面试验得到酚酸脱羧酶诱导表达的最佳条件为:2×YT培养基,诱导温度30°C,接种量1.78%,诱导时机3.8 h,IPTG1.25mmol/L,诱导时间18h,此时预测酶活和实际酶活分别为47.61IU/mL和47.55IU/mL。【结论】应用响应面法优化酚酸脱羧酶的诱导表达是可行的,本试验为以后生产稳定、高产的酚酸脱羧酶以及了解其催化机理提供了重要的理论基础。     

Analysis of the function of a hyperthermophilic endoglucanase from Pyrococcus horikoshii that hydrolyzes crystalline cellulose

A hyperthermophilic -1,4 endoglucanase was identified in Pyrococcus horikoshii, a hyperthermophilic archaeon. In order to clarify the function of the protein in detail, structural and catalytic site studies were performed using protein engineering. By removing some of the C-terminal sequence of the ORF of the endoglucanase (PH1171), two types of recombinant proteins were expressed from one ORF, using Escherichia coli. One exhibited endoglucanase activity, and the other did not. An SD-like sequence was identified in the ORF of the endoglucanase. By removing the SD-like sequence without changing the amino acid sequence of the endoglucanase, one recombinant endoglucanase was prepared effectively from E. coli. From the analysis of the N- and C-terminal regions of the ORF, this endoglucanase appears to be a secreted and membrane-binding enzyme of P. horikoshii. A mutation analysis of the endoglucanase, using the synthetic substrate, indicated that Glu342 is a candidate for the active center and plays a critical role in the activity of the enzyme. Additional catalytic amino acid residues were not found. These results indicate that the catalytic residue of the enzyme is different from that of typical family 5 endoglucanase, even though it has a high homology to the endoglucanase from Acidothermus celluloliticus. The activity of the enzyme, using carboxy methylcellulose and crystalline cellulose as the substrates, was increased, but not for a synthetic low-molecular substrate when a carbohydrate-binding module of chitinase from P. furiosus was added to the C-terminal region.