限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

噬菌体对国内谷氨酸生产菌的鉴别

利用噬菌体的宿主专一性,对收集的国内用于生产的谷氨酸生产菌进行鉴别,发现一株7338菌株对T6—13噬菌体敏感,而对7338的噬菌体不敏感。根据上述事实,工厂中为防止噬菌体侵袭,轮换使用不同菌株时,提出要了解菌株对不同噬菌体的敏感性,以免感染造成巨大经济损失。     

抗噬菌体工程菌的筛选

噬菌体污染常引起溶菌,造成人力物力浪费。应用自发突变的原理成功地从溶菌液中筛选到抗噬菌体的工程菌株;在发酵罐中培养,该菌株生长行为和表达水平没有变化。     

短小芽孢杆菌1037抗温和性噬菌体菌株的筛选及投产

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)260/52诱筛的1037菌株,在500升罐上产碱性蛋白酶的能力稳定在8,000单位/毫升以上,生产能力较出发菌株提高40％以上。但该菌株在10吨罐上的产酶水平并不高于出发菌株。发酵中表现出二级种子种龄显著延长,发酵周期延长,产酶速率低,泡沫增多,菌体生长略有下降等异常现象。发酵液经平板检查出现噬菌斑,从而证明为噬菌体感染。于是,开展了短小芽孢杆菌抗噬菌体菌株的筛选工作。本文报道有关噬菌体抗性菌株的筛选过程及投产情况。     

一种用分子杂交技术检测谷氨酸生产菌溶原性的方法

谷氨酸生产菌用于发酵生产谷氨酸和其他氨基酸,由于外源噬菌体污染或者由溶原菌内诱导出的噬菌体污染,往往给工业发酵带来严重的危害,于是测定谷氨酸生产菌是否为溶原菌便成了当务之急。本文以溶原菌E.coli K_(12)为研究模型,首先用~(32)P标记的λDNA作探针,建立了检测溶原菌株的分子诊断方法,继而通过寄主菌株从生产环境样品中分离筛选到7_6和7_(?)两大类共20多株噬菌体。由该两类噬菌体制得的~(32)P-7_(?)和7_(?)探针,可分别与以生产谷氨酸的棒杆菌B_9、7338和T_(?)三个菌株为寄主,从环境样品中分离的18个和6个噬菌体分离物杂交。而采用缺口翻译系统制备的7_(?)和7_(?)混合探针,或混合使用7_(?)和(?)探针,使得检测方法更为简便易行。通过Southern Blot技术和菌落杂交对菌DNA的分析,结果表明三个寄主菌株均不是所分离的噬菌体的溶原菌。最后,本文还就烈性噬菌体和温和噬菌体之间的同源性与分子诊断的可行性作了初步探讨。     

中性蛋白酶生产菌AS1.398抗噬菌体菌株的选育和诱变

我厂生产AS 1.398中性蛋白酶,自1969年投产以来,曾多次发生噬菌体污染。1977年7、8月份再度发生异常发酵:芽孢出现早,发展快,周期短,酶活低。但没有典型的溶菌现象,经反复检查,才证实有噬菌体的污染。当时本厂所保藏的其它菌株对该噬菌体全部敏感。经过筛选得到了抗噬菌体菌株KC34,生产性能与原生产株基本一致。以后,又对该菌株进行了硫酸二乙酯、紫外线联合诱变,得到了变异株Kpb 38,其摇瓶产酶比KC34提高20%以上。经大生产九个月,200多批次检验,增产效果显著,与摇瓶情况完全相符。认为Kpb 38菌株属优良的蛋白酶产生菌。     

1株产L-天冬氨酸酶大肠埃希菌噬菌体分离和生理特性初步研究

对产L-天冬氨酸酶大肠埃希菌噬菌体进行分离和生理特性研究,有助于为生产过程中噬菌体污染的防治提供指导。采用双层平板法对噬菌体进行分离纯化。利用透射电镜观察噬菌体形态。进行噬菌体全基因组测序和比对。通过测定不同处理条件下噬菌体活性,研究温度、pH、有机溶剂氯仿、去垢剂SDS对噬菌体的影响。从噬菌体污染的L 天冬氨酸酶生产菌种大肠埃希菌HY-05C发酵培养液中分离出1株噬菌体。电镜结果表明,该噬菌体由呈多面体对称的头部和极短的尾部构成。基因组测序和比对结果表明,噬菌体与T7样噬菌体的相似性最高。生理特性研究表明,噬菌体对高温和去垢剂SDS敏感,对有机溶剂氯仿不敏感;最适pH为7.0,碱性条件下活力较为稳定,酸性条件容易失活。噬菌体保藏编号为CICC 80001。     

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育

在红霉素生产过程中,曾多次出现噬菌体的感染。我们从被感染的发酵自溶液中分离出7株噬菌体,并用电子显微镜观察了P1、P3、P6的形态。以不同类型的噬菌体选育出抗噬菌体菌株,其中一些抗性菌株的抗菌素产量,比敏感的出发菌株高,曾先后用于生产。用噬菌体处理得到的抗性菌株的产量,比用物理或化学诱变因素处理得到的菌株提高幅度大。     

牡丹内生菌JP13的产β-甘露聚糖酶活性及鉴定

以凤丹牡丹为材料,采用组织分离法从其营养器官分离株筛选出一株产β-甘露聚糖酶菌株,编号为JP13。经过魔芋粉鉴别培养基初筛,初步判断JP13具有产β-甘露聚糖酶活性;采用DNS法对菌株JP13经过54 h连续发酵液每6 h进行一次β-甘露聚糖酶活性测定,结果表明,发酵培养开始后的每次测定均能检测到β-甘露聚糖酶活性,发酵30 h酶活性达到最大值11.2 U/m L,确定JP13为产β-甘露聚糖酶菌株。通过显微观察、生化特性测定和16S r DNA序列分析,确定菌株JP13隶属于芽孢杆菌属Bacillus,暂命名为Bacillus sp.JP13。菌株JP13丰富了产β-甘露聚糖酶野生菌株资源,对拓展凤丹牡丹的开发应用提供了新的切入点。     

万古霉素产生菌抗噬菌体突变株的选育

在万古霉素的生产过程中,发现菌丝体突然自溶,经噬菌斑检查,证明是噬菌体侵染所引起的。用噬菌体或噬菌体、紫外线复合处理敏感菌株东方链霉菌(Streptomycesortentalis) 3746,得到抗噬菌体突变株72-4-863、72-5-1077和72-6-1306,产万古霉素的单位也较敏感株3746提高500一1000单位／毫升。     

一株具有噬菌体抗性的芽孢杆菌BS-2的鉴定及葡萄糖流加工艺优化

筛选噬菌体抗性菌株以解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生产过程中噬菌体污染问题并提高抗性菌株的发酵水平。采用双层平板法从异常发酵液中分离并纯化以枯草芽孢杆菌为宿主的噬菌体,利用纯化得到的噬菌体筛选实验室芽孢杆菌库以得到抗性菌株,结合16S rDNA和gyrA基因序列进行系统发育分析确定其分类地位,以分批发酵的生长曲线及葡萄糖含量曲线作为基础,对发酵培养基的初糖浓度及葡萄糖的流加方式进行优化提高筛选到的噬菌体抗性菌株的发酵水平。从异常发酵液中分离到噬菌体S01及S02并在实验室芽孢杆菌库中筛选到一株噬菌体无法侵染的芽孢杆菌BS-2,结合16S rDNA及gyrA基因序列的系统发育分析将BS-2鉴定为枯草芽孢杆菌,按照葡萄糖初始浓度15 g/L,葡萄糖浓度低于5 g/L时以2 g/L·h的速度流加葡萄糖,补加量10 g/L的流加补料方法,可以将发酵水平提高至2.43×1010 CFU/mL。枯草芽孢杆菌BS-2具有较好的噬菌体抗性且经过工艺优化可以达到较高发酵水平,有较强工业化应用潜力。     

耐温性L-谷氨酸发酵菌种的选育

应用基因组改组技术提高,L-谷氨酸生产菌在高温发酵条件下的谷氨酸产量。以天津短杆菌T6—13变异株SW07-1为原始亲株,分别经紫外线（UV）-硫酸二乙酯（DES）和X射线诱变,获得5株耐温性能略有提高的突变菌株。经2轮基因组改组,获得耐高温（能在44℃生长）的L-谷氨酸菌株F2-50。F2—50在38℃下,摇瓶发酵40h,发酵液中L-谷氨酸浓度比原始出发菌株提高了近41％,在41℃高温下,摇瓶发酵40h,L-谷氨酸浓度比原始出发菌株提高了近2倍。     

柠檬酸发酵高温生产菌株选育

以黑曲霉(Aspergillus niger)H-142为出发菌株,通过r-射线、硫酸二乙酯及高温热处理单独或复合诱变,并采用高温、高酸及高渗培养条件定向筛选,从600多株突变株中筛选出一支耐高温柠檬酸高产菌株HQL-601。其发酵温度为40-41℃,周期60—64小时,20％山芋粉摇瓶产酸13％。发酵液的高压液相色谱分析结果表明,其产酸组成明显优于现生产菌株。     

谷氨酸发酵中二价阳离子对噬菌体抑制作用初步观察

本文报道适当浓度的Ca²⁺、Fe²⁺在发酵液中能抑制噬菌体530对谷氨酸生产菌株T₆^-13、B₄的裂解,谷氨酸发酵产量不低于对照菌株。     

抗菌活性海洋真菌HN4-13的鉴定及其发酵优化

[目的]鉴定一株来源于连云港近岸海域沉积物并具有分泌抗菌活性代谢产物的真菌菌株HN4-13,优化其合成抗菌活性物质的发酵条件.[方法]通过形态学观察及ITS序列分析方法对菌株HN4-13进行鉴定;通过基础发酵培养基筛选、碳氮源及无机盐的单因素试验,继而采用正交试验设计优化其合成抗菌活性物质的发酵条件.[结果]菌株HN4-13被鉴定为黄柄曲霉(Aspergillus flavipes),其分泌抗菌活性产物的发酵条件为:4％蔗糖、0.5％蛋白胨、0.1％ KCl、0.06％ NaH2PO4、28℃、1％接种量、160 r/min培养9d.[结论]实验结果为进一步分离纯化菌株HN4-13所产抗菌活性代谢产物提供了基础.     

谷氨酸发酵中噬菌体的污染与防治

在谷氨酸发酵生产中,倘若污染噬菌体,轻则减产,重则倒罐,造成严重损失。所以防治噬菌体的污染是很重要的,现分述如下。一、噬菌体是什么? 噬菌体是病毒的一种,是一种极微小的生物,体积是细菌的1/1000左右,它可以通过细菌过滤器,只有在电子显微镜下才能看到。其特性如下: 1.从形态学角度分噬菌体为六群:1、2、3     

抗噬菌体菌株C224发酵生产2KG的条件试验

以ZKG生产菌株球状节杆菌K1022为出发菌株,选育出的抗噬菌体菌株C224发酵条件试验的实验结果表明:C224菌能利用淀粉水解糖、葡萄糖酸钙、葡萄糖发酵产生2KG;以葡萄糖为原料发酵生产2KG的条件为:接种量8％以上,250mL摇瓶装量20mL,31℃265r/min,振荡培养72h;发酵最佳配比组成为:葡萄糖18％,玉米浆1.65％,尿素0％,KH_2PO_4 0.0015％,CaCO_3 5％。     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

一株以葡萄糖为底物产2,3-丁二醇微生物菌株的筛选及鉴定

从自然界中筛选出一批以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇的菌株,经初步发酵测定发酵液中2,3-丁二醇含量,其中菌株6-7的2,3-丁二醇产量最高达49.6g/L。对其进行常规生理生化鉴定实验,并结合16SrDNA序列分析,比对结果表明,菌株6-7与Bacillus subtilis strain BIHB332相似性达99%。在细菌分类学上属于枯草芽孢杆菌属,将其命名为Bacillussubtilis6-7。其特点是属于环境友好和食品安全型菌株,因此,利用Bacillus subtilis6-7生产2,3-丁二醇具有良好的工业应用价值。