高通量测序序列比对研究综述

高通量测序技术的飞速发展,给生物信息学带来了新的机遇和挑战,第二代测序序列数量多、长度短使得原来的序列分析手段不再适用。近几年来,针对高通量测序的序列分析算法和软件日益增多,目前已有上百种,导致选择合适的软件成为一个难题。对第二代测序的测序类型、序列类型以及分析算法进行了总结和归纳,对现今常用的分析软件的序列的类型、长度以及软件应用算法、输入/输出格式、特点和功能等方面做了详细分析和比较并给出建议。分析了现今测序技术和序列分析存在的问题,预测了今后的发展方向。     

新型的NDA序列测定策略：PCR产物直接测序

ＤＮＡ序列的测定在现代分子生物学中的应用越来越广泛 ,传统的模板制备方法是将待测序列的ＤＮＡ片段插入质粒或病毒载体中 ,然后让其在宿主细菌细胞中增殖。尽管这套方法已被简化和标准化 ,但由于其涉及到活细胞的保存和使用 ,不可避免地会带来诸如载体和宿主细胞基因发生突变等不利影响。而用ＰＣＲ技术直接从基因组或克隆片段制备测序模板 ,可以完全避免细菌培养、模板提取等重复性操作 ,也克服了以上弊端 ;由于ＰＣＲ技术快速、简便 ,在检测人类遗传病的基因突变时 ,需要比较患者和正常人中的突变分布情况 ,应用ＰＣＲ直接测序技术就能…     

运用多重PCR-直接测序法检测ABO基因型及其遗传多态性

根据ABO基因座第6和7外显子9个SNP位点设计引物, 复合扩增后直接测序, 根据测序结果判定不同物证检材ABO基因型及其在藏族群体中的多态性分布。成功地检测出经过不同方法处理的血痕、毛发、口腔拭子、骨骼、混合斑等101例腐败、降解及微量检材的ABO基因型, 结果与免疫血清学分型一致, 且该方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单、结果准确、客观及能够发现新等位基因等优点。对80名青海藏族无关个体的调查表明, ABO基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡, 杂合度H为0.675, 多态信息含量PIC为0.672, 个人识别力DP值为0.874, 非父排除率PE值为0.391, 偶合度I为0.126; 青海藏族ABO等位基因频率O>B>A, 且O等位基因频率高达0.6125。多重PCR-直接测序法检测ABO基因型适用于法医学不同来源的样本, 提高了ABO血型系统的个体识别能力; ABO基因型在青海藏族人群中的分布具有较高多态性, 可用于法医学个体识别及群体遗传学研究。     

Illumina-Solexa测序数据质量评估系统的构建

目的：针对下一代测序数据量大、序列长度短的特点,研究数据分析和质量评估方法。方法：选择已发布的Illumina-Solexa平台测序数据为研究对象,通过MAQ软件将测序数据与人类全基因组序列进行比对,并以外显子区域为例,在位点水平对测序数据质量进行评估。结果：结合已有软件系统和本文自创线性算法,建立了一套包括比对、拼接在内的测序数据质量评估系统。比对分析后,发现原始测序序列共覆盖了127,113,378个位点,涉及24条染色体上的64868个外显子。其中,每个位点都被测到的外显子为0.50%,位点平均测序深度大于等于1的外显子为3.98%。结论：成功构建了基于Illumina-Solexa测序平台的数据分析和质量评估方法,其可适用于其它第二代测序平台。研究者可在质量评估的基础上完善测序试验设计,并进行SNP和突变筛选及后续功能性研究。     

快速可靠的双链PCR产物直接测序法

利用T7DNA聚合酶在低温下仍具较高活性的特点,在热变性后低温下进行测序反应,使用该方法对多种PCR产物进行序列分析均取得较好的结果．     

四种常用的生物序列比对软件比较

随着高通量测序技术的快速发展,下一代测序技术也迅速发展为生物领域中的主流技术,而理解下一代测序数据最重要的一步是比对。比对是进行后续生物信息分析的基石,也因此催生了很多比对软件。本文主要选取了四种常用的比对软件Bowtie2、BWA、MAQ和SOAP2,对这四种软件及算法进行综述,并通过实际测序数据对四种软件进行比较和评估,为生物学研究者选择最佳的短序列比对软件提供理论和实践依据。     

DNA序列的甲基化特征提取软件

提取(量化)特征是DNA甲基化状态预测中的一个关键步骤,然而不同的方法所使用的特征并不相同,特征量化的具体过程计算繁琐。本文集成文献中的重要特征,设计并实现了DNA序列的特征提取软件工具。该软件封装了特征的计算过程,可以方便地批量计算目标序列的相关特征,为后续的数据分析和挖掘提供便利。     

血浆游离DNA全基因组甲基化测序的实用稳定性评估

随着液体活检技术的发展,血浆游离DNA成为当前的研究热点之一。血浆游离DNA的全基因组甲基化测序被认为在癌症检测等医学应用拥有巨大潜力,但目前尚缺乏针对该实验流程的实用稳定性评估。文中利用两名志愿者在不同时间采样的血浆游离DNA,在不同实验平台分别进行DNA甲基化的重亚硫酸盐转化前建库(Pre-BS)、转化后建库(Post-BS)和常规DNA建库,获取多因素影响下的测序数据样本。在此基础上,建立了一套血浆游离DNA测序数据分析的质量控制参考流程,综合评估了血液采集提取、游离DNA建库测序过程的实用稳定性,为血浆游离DNA全基因组甲基化测序应用于临床液体活检提供实用性的基础参考。     

癌症液体活检新思路：数字PCR检测DNA甲基化

癌症的早期诊断可提高患者生存率.微创采集人体体液的液体活检方法可避免传统肿瘤组织活检方法侵入性和异质性的问题,逐渐成为癌症诊断的新方式.另外,DNA甲基化作为预测癌症发生发展的标志物,引起了越来越多研究者的关注.但传统DNA甲基化的检测方法灵敏度不高,且容易出现假阳性.近年来,数字PCR技术因其超高的检测灵敏度和精确度、无需标准曲线即可进行核酸绝对定量检测的优势,被用于DNA甲基化的定量检测中.本文首先介绍了DNA甲基化与癌症发生发展的关系,总结了传统DNA甲基化检测方法及其在癌症临床诊断中的应用,阐述了基于不同核酸样本分散方法的数字PCR技术及其在微量DNA甲基化检测中的优势,总结了采用数字PCR技术检测癌症患者体液中DNA甲基化的具体步骤,列举了数字PCR技术在癌症DNA甲基化检测中的研究成果及应用进展,最后提出了数字PCR技术检测癌症DNA甲基化未来可能面临的挑战,并对数字PCR技术在癌症液体活检方面的应用前景进行了展望.     

纳米孔基因测序技术在DNA甲基化修饰检测中的应用研究进展

DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰类型之一,其中哺乳动物基因组中最常见的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)甲基化修饰参与了许多重要的生命活动,其含量的异常与疾病,尤其是癌症的发生发展密切相关。当前检测5mC修饰最常用的方法是基于亚硫酸氢盐转化的第二代基因测序技术,该方法虽然转化效率高且测定准确,但仍然存在不足之处,包括DNA分子降解、处理过程繁杂、测序读长较短、检测特异性不高等。近些年发展起来的纳米孔基因测序技术凭借其能对DNA修饰直接进行检测,且具有读长长、通量高、速度快等特点,在DNA表观遗传修饰检测方面展现了良好优势。本文对DNA的5mC修饰的形成及其经典的检测方法进行了简要介绍,并重点介绍了纳米孔基因测序技术在DNA的5mC修饰检测中的应用研究进展。     

亚硫酸氢钠测序法检测水稻FIE基因CpG岛甲基化状态

建立了适用于水稻基因组特定基因甲基化检测的亚硫酸氢钠测序法,并利用此方法对FIE2A基因CpG岛部分片段的甲基化差异进行了研究。采用CTAB法提取水稻叶片和胚乳细胞的基因组DNA,经亚硫酸氢钠化学修饰后,针对已修饰的FIE基因序列设计特异引物并结合巢式PCR扩增,TA载体克隆、测序,最后对测序结果进行分析。结果表明巢式PCR能够增加特异性产物的产生,FIE基因CpG岛在对称的CG和CNG位点甲基化水平较高,而在非对称CNN位点甲基化水平最低,此外在叶片中的平均甲基化水平较高。由此表明本研究建立的亚硫酸氢钠测序法适用于水稻基因组特定基因甲基化状态的检测。     

筛选转基因动物的新方法——PCR及其产物测序法

用特异性引物对肌球蛋白轻链2启动子(myosin light chain-2,MLC₂)-糜酶融合基因的转基因新生鼠鼠尾DNA进行PCR筛选, 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性样品PCR所扩出的DNA条带,纯化后用同一对引物中的一个进行单引物PCR测序,与所转外源基因序列比较,进一步确定整合有外源基因的阳性鼠.PCR及PCR 产物测序法检测转基因动物具有操作方便,灵敏度高及特异性强等优点.     

PCR产物直接测序技术中影响因素的研究

探讨了PCR产物直接测序技术中的影响因素,结果表明：PCR产物特异性是影响其测序成败的关键因素,PCR反应只有产生惟一扩增产物时,其产物才能被用来直接测序;PCR反应体系残留混合物（dNTP、引物和盐离子等）对其测序质量有明显不利影响,PCR产物纯化后其测序质量能明显提高;同时,PCR产物大小不同,其测序反应的模板用量也不同,在一定长度范围内,最适模板用量随PCR产物长度增加而增加。 Factors that Influence Direct Sequencing of PCR Products XU Zu-yuan1,2,BAO Qi-yu1,NIU Yu-xin1 1.Beijing Genomics Institute / Human Genome Center,Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China; 2.Jingzhou Teachers College,Jingzhou,Hubei 434104,China Abstract:Factors influenced direct sequencing of PCR (polymerase chain reaction) products were investigated in this paper.It showed that the specialization of PCR products played a key role in their sequencing reactions and only which could be sequenced directly.It also showed that the PCR reaction residues (including dNTP,primers,and metal ion) affected badly on the sequencing quality,so the purification of PCR products was necessary before sequencing.In addition,the optimum templates amount in sequencing reaction rose with the increasing of their DNA size in a certain range. Key words：polymerase chain reaction(PCR); direct sequencing of PCR product; ABI 377-DNA sequencer; Q20     

六妹羊肚菌PacBio基因组测序和DNA 6mA甲基化分析

羊肚菌属于子囊门真菌,是世界范围内最受欢迎的食用菌之一。本研究通过PacBio单分子实时测序技术对我国四川省成功栽培的六妹羊肚菌Morchella sextelata SCLS菌株进行全基因组测序,获得其高质量核基因组组装,大小为53.57Mb,重复序列含量为17.03%,包含42条重叠群（contigs）,重叠群N50高达1.82Mb,其中13条重叠群两端均含有端粒重复序列,为完整的染色体。通过链特异性RNA-seq测序和转录本拼接,并结合多种基因预测策略,预测到13 182个蛋白编码基因,包括267个碳水化合物活性酶,11个次生代谢产物合成基因簇。通过与内蒙古地区栽培的六妹羊肚菌菌株NZTD180501373基因组比较发现,六妹羊肚菌进化过程中可能发生过染色体重组事件,二者具有33 055个SNP和48 726个InDel位点差异,并且各自拥有超过6Mb的特有序列。此外,相比于梯棱羊肚菌M. importuna,六妹羊肚菌SCLS菌株中与逆转录转座酶有关的orthogroup发生了扩张,并且拥有5个成员数超过100的特有逆转录转座酶基因家族。对SCLS菌株中的DNA N⁶腺嘌呤甲基化（6mA）修饰进行了鉴定,发现SCLS菌株基因组中0.42%的腺嘌呤被6mA甲基化,其含量显著高于已报道的6种双核亚界（Dikarya）真菌。6mA甲基化位点在逆转录转座子上显著富集,表明六妹羊肚菌中6mA甲基化可能调控逆转录转座子的活性,这也是首次在真菌中报道6mA甲基化与转座子相关。     

杂草稻叶绿体籼粳分化的多重PCR分析

通过分析籼稻93-11和粳稻培矮64S的叶绿体全基因组,优化和构建了籼粳分化的叶绿体分子标记ORF100和ORF29-TrnC^GCA的多重PCR。应用这个多重PCR对200余份世界各地杂草稻和其它水稻材料进行分析。结果表明:杂草稻中有明显的叶绿体籼粳分化,表现出明显的地域性,且与传统的中国栽培稻的南籼北粳能较好的对应。推测粳型杂草稻可能是栽培稻突变或粳型水稻(作母本)与其它类型水稻材料杂交而形成的。     

影响多重PCR扩增效果的因素

不同循环参数、PCR缓冲液及反应体积的对比实验表明,循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果,而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。     

多种食源性致病菌检测的多重PCR 方法的研究

目的:利用多重PCR技术,建立可以同时检测多种食源性致病菌的多重PCR方法。方法:分别选择沙门氏菌invA基因,志贺氏菌的ipaH基因,单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因,大肠杆菌O157:H7的eaeA基因,副溶血弧菌的toxR基因,设计多重PCR引物,建立多重PCR检测体系,并对该体系进行特异性和灵敏度实验。结果:通过对19株菌株进行实验,所有的目标菌株均为阳性,而其余菌株为阴性。对多重PCR体系的灵敏度进行考察,沙门菌的灵敏度为5000 CFU/mL;志贺氏菌的灵敏度为5500CFU/mL;单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为5200 CFU/mL;O157:H7的灵敏度为5000CFU/mL;副溶血弧菌的灵敏度为6300CFU/mL。结论:建立的多重PCR体系能实现多种致病菌同时检测。     

MethyScan：一种甲基化特异性PCR引物设计及评估工具

DNA甲基化是重要的表观遗传现象,对基因表达发挥重要调控功能.大量研究表明,基因DNA甲基化是重要的临床诊断生物标志物.在临床上,实施快速、准确的DNA甲基化状态检测是诊断应用的前提和关键.甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)通过将两种引物与甲基化、非甲基化模板各自特异性结合和扩增,实现基因甲基化状态的区分,是切实可行、简单便捷的临床诊断实验技术.但是,不同于常规PCR,MSP主要存在如何强化引物-甲基化/非甲基化模板特异性结合、降低引物序列Tm值差异、去除假阳性扩增及提高敏感性等四大难点.尽管大多数MSP引物设计软件对上述难题都提出了各自解决办法,但在引物设计影响因素考虑、设计与评估并行处理及特异性扩增预测等方面仍然存在较大缺陷.为此,本研究通过对MethPrimer、MSPPrimer、MethBlast、BiSearch等现有MSP引物设计软件原理的深入探究,以及对Bowtie、SAMtools和BEDTools等工具的有效综合整合,基于图形库Matplotlib和第三方Python功能库BioPython与Primer3-py实现了具有系列优点的甲基化特异性PCR引物设计与评估可视化工具MethyScan.它具有引物设计、基因组索引、引物评估等三大完整功能模块,不仅可快速进行MSP引物设计,实现巢式(Nested)引物适配,还可基于4种基因组碱基转换模板分析引物结合信息,图形化展示非特异性扩增与目的片段差异,从而综合评估引物特异性-非特异性扩增.同时,对食管癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中6个潜在生物标志物TFPI-2、NDRG4、CDKN2A、CD44、CASP8和SDHD的甲基化引物设计对比结果表明,MethyScan不仅可获得更多CpG位点的检测引物,而且所获得MSP引物位置与其他软件结果相同或相近,且引物间Tm值差值更小.总之,作为首个图形化展示特异性-非特异性扩增差异MSP引物设计工具,MethyScan可有效提高甲基化引物设计准确性,为临床DNA甲基化检测项目开展、检测试验实施及诊断试剂盒研发提供有力支撑.MethyScan工具下载地址:https://github.com/bioinfo-ibms-pumc/MethyScan.     

玉米MuDR转座子DNA甲基化的MSP检测

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,广泛存在于高等动植物中,并在维持基因组稳定性、调节基因表达等方面起着重要作用,因此建立快速有效地DNA甲基化检测技术至关重要.本文以两种不同MuDR活性的玉米转座子材料为研究对象, 探讨了甲基化特异性PCR(MSP)在检测DNA甲基化的有效性.结果表明: MSP技术可快速有效地检测MuDR转座子的末端反向重复(TIRs)序列内的CpG岛DNA甲基化的变化,灵敏度高,特异性强,可作为植物已知基因DNA甲基化检测的一种新方法.同时利用MSP研究发现,玉米MuDR转座子的活性随其TIRs序列内的CpG岛DNA甲基化的变化而改变, DNA甲基化是调控玉米MuDR转座活性的重要分子机制之一.     

PCR产物直接测序还是克隆测序 密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属（Athrotaxis）植物rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列进行了测定与分析。实验表明A. selaginoides rDNA重复序列间的纯合程度很高, 对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A. laxifolia、A. cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低,各重复单位间序列存在插入/缺失,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A. laxifolia、A. cupressoides的ITS2区尽管也存在 多态性,但不同重复序列的浓度比较平均,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同,同一植物ITS的不同区域,其重复序列间的纯合程度也不同,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。