~(21)Ala定点突变胰高血糖素及结构与功能变化

 胰高血糖素是由 2 9个氨基酸组成的多肽激素 ,具有促糖元分解的生理功能 ,其拮抗剂有治疗糖尿病病人的潜在应用价值 .在获得重组胰高血糖素基因工程菌基础上 ,利用定点突变技术改造其第 2 1位氨基酸天冬氨酸为丙氨酸 ,并经DNA测序证明胰高血糖素基因发生了点突变 .用IPTG诱导表达后 ,经亲和层析和反相高效液相层析 ,纯化到突变型重组2 1Ala 胰高血糖素 .质谱测定分子量与理论值相符 .利用园二色谱比较重组胰高血糖素和突变的2 1Ala 胰高血糖素在TFE中的二级结构 ,发现胰高血糖素以α螺旋为主要二级结构 ,2 1Ala 胰高血糖素仍有α螺旋结构特征 ,并且含量有所增大 .利用兔升血糖试验 ,发现2 1Ala 胰高血糖素生物活性比重组胰高血糖素减少 51 % (P <0 .0 1 ) .显示天然胰高血糖素第 2 1位氨基酸天冬氨酸与形成α螺旋结构关系不大 ,但在发挥胰高血糖素的生物功能中有重要作用 ,与其可作为钙离子结合位点 ,参与胰高血糖素和受体结合的潜在功能密切相关 .     

基于定点突变的植物Ⅲ型聚酮合酶结构与功能研究进展

植物Ⅲ型聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)催化形成一系列结构迥异、生理活性不同的聚酮类化合物的基本骨架结构,是聚酮类化合物生物合成途径的关键酶。目前已从植物中克隆和鉴定了多种功能不同的Ⅲ型PKSs。定点突变技术是研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要方法。文中综述了近年来基于定点突变的植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究进展,包括利用定点突变技术修饰各种可能影响植物Ⅲ型PKSs结构的氨基酸残基,来研究其对功能的影响(如控制起始底物的特异性、缩合反应次数以及中间产物环化方式),以期为植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究提供参考。     

PSS定点突变及酶活研究

磷脂酰丝氨酸可在磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)催化下由磷脂酰胆碱和L-丝氨酸生成。通过生物信息学手段对磷脂酰丝氨酸合成酶蛋白质结构进行解析和研究分析,获得2个可突变位点F139和P272,通过Overlap PCR法进行定点突变,测定突变序列,并进行酶活测定。结果显示,PSS位点F139突变为L139、M139,位点P272突变为A272,能提高酶活力,说明蛋白质结构解析结合氨基酸定点突变技术,可以改善重组酶的活力。     

青霉素G酰化酶β亚基Ser~(579)、Arg~(580)的定点突变研究

比较青霉素酰化酶(PGA)和青霉素结合蛋白的一级结构,我们推测PGAβ亚基中565～595肽段可能和酶的底物结合功能有关。为此我们将2.6 kb 长的完整的PGA 基因克隆到pTz 18 U 中构建成质粒pTZGA,并用定点突变的技术对Ser~(579)。和Arg~(580)两个氨基酸残基进行了突变研究。在所得到的四种突变子中·Ser~(579)→Gly~(579),Arg~(580)→Gly~(580),Arg~(580)→Glu~(580),Arg~(580)→Lys~(580))Glu~(580)和Gly~(580)没有酶活力,Lys~(580)约有30%的酶活力,Gly~(579)约有70%的酶活力。用ELISA 方法检测了四种突变子和野生型酶蛋白表达量,没有显著差异,这表明Arg~(580)对酶活性有重要意义,是酶活力中心的重要组成部分,可能与催化活性有关。     

家蚕吡哆醛激酶基因定点突变及突变体功能

【目的】吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK）是维生素B₆关键代谢酶。前期研究克隆出家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶cDNA,经序列比对发现几个重要且保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。为明确家蚕吡哆醛激酶分子若干特定位置上氨基酸残基在酶功能上的作用进行本研究。【方法】采用重叠延伸法对家蚕吡哆醛激酶Thr⁴⁷,Asn¹²¹, Ile⁵⁴, Arg⁸⁸和Trp²³⁰氨基酸残基进行定点突变, 构建表达载体pET-22b（+）-PLK并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中进行诱导表达,经亲和层析对重组蛋白进行纯化, 通过酶活性检测进行功能鉴定。【结果】家蚕吡哆醛激酶Thr⁴⁷,Ile⁵⁴和Arg⁸⁸氨基酸突变后酶的催化活力分别下降82%, 58%和85%;Asn¹²¹突变对酶的催化活力几乎没有影响;而Trp²³⁰突变导致酶丧失催化活性。【结论】本研究明确了选定氨基酸侧链基团在家蚕吡哆醛激酶催化功能上的意义。     

定点突变技术研究苏云金杆菌Cry1类晶体蛋白结构与功能的进展

近年来利用定点突变技术研究苏云金杆菌（Bacillus thuringiesis,Bt）杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICP）作用机制已取得良好进展.杀虫晶体蛋白不同结构域上氨基酸残基的突变将影响其稳定性,与受体的结合,不可逆的昆虫中肠膜插入及离子通道活性的强弱等.突变研究表明,结构域Ⅰ参与不可逆结合及插入昆虫中肠膜过程;结构域Ⅱ参与受体结合,包括初始结合与不可逆结合;结构域Ⅲ在杀虫特异性和维持三维结构的稳定性方面起重要作用,同时,可能参与离子通道的形成,受体结合和插入昆虫中肠膜过程.利用各种定点突变技术对各位点进行突变可以研究单一位点的功能,到目前为止,已有很多关于这方面的研究,并且筛选到了毒力提高的工程菌株.     

藻胆体核亚基ApcD定点突变及体内重组功能研究

在对Anabaena sp.PCC7120藻胆体核亚基ApcD结合色素PCB的体内重组中,发现色素蛋白在提纯前后最大吸收峰和荧光峰发生了红移,从提纯前的605nm及633nm变为提纯后的650nm及665nm.为了研究该现象的原因,构建了ApcD的8个突变体,重组结果显示:突变体ApcD(Y88I)色素蛋白在提纯后的吸收光谱和荧光光谱较提纯前均多出一个峰,分别为668nm,690nm;ApcD(W59Q)、ApcD(Y73A)、ApcD(W87E)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱一致;ApcD(M126S)、ApcD(Y116S)、ApcD(M160T)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱一致,而提纯后的荧光峰位置较提纯前分别红移了5nm、7nm和10nm;ApcD(M115I)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱均发生了红移,从提纯前的605nm和633nm变为提纯后的638nm和655nm.这些色素蛋白在酸性尿素溶液变性条件下的最大吸收峰始终在662nm,表明辅基色素仍然是藻蓝胆素;在对PCB-ApcD、PCB-ApcD(Y116S)及PCB-ApcD(M160T)的圆二色谱分析发现,该两个氨基酸的突变均...     

定点突变人α_(99)、β_(82)位的血红蛋白及在大肠杆菌中的表达

模拟分析发现血红蛋白两条α珠蛋白链上 99位的 Lys突变为 Cys后 ,它们之间可以形成二硫键 ,两条β珠蛋白链上 82位的 Lys突变为 Cys后可以增加血红蛋白四聚体间氢键的作用 ,分别起到稳定四聚体的作用 .利用寡核苷酸介导的定点突变技术将α99、β82 位的 Lys突变为 Cys.将突变后的血红蛋白插入 p BV2 2 0载体 ,在大肠杆菌中获得了高效表达 ,其表达产物达细菌总蛋白的2 0 %左右 ,并经 Western印迹证实     

取代环丁烷结构的非肽类胰高血糖素样肽-1受体激动剂

应用胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）及其类似物治疗2型糖尿病是代谢性疾病研究领域近年来的热点,尤其是胰高血糖素样肽-1独特的作用机制倍受业界的关注。它能同时作用于2型糖尿病的多个发病环节,在有效降低血糖的同时,避免低血糖的发生并能减轻体重。但这类药物因其多肽性质而存在诸多的使用限制（如需反复注射）。简要介绍一类取代环丁烷结构的新型非肽类胰高血糖素样肽-1受体小分子激动剂的发现过程、基本药理学特征和体内抗糖尿病和抗肥胖症效应。     

酵母与大肠杆菌穿梭定点突变载体系统的构建及应用

利用可以在大肠杆菌中形成单链又可以在大肠杆菌和酵母中穿梭的质粒BFDl9作为寡聚核苷酸介导的定点突变载体,分别在大肠杆菌和酵母中获得了预定的TRP1基因突变体,再利用这个带TRP1突变的质粒BFD25和BFDl9,建立了一个在酵母系统中进行定点突变时可以富集突变体的筛选方法。借助这种方法我们在酵母系统中完成了人表皮生长因子基因表达单元的寡聚核苷酸介导的缺失突变,此突变载体系统在酵母与大肠杆菌中都适用,而且可以直接在酵母细胞中进行突变表型的研究。     

噬菌体展示的豆蔻酰转移酶抑制肽序列结构和功能研究

对一个具有很强的抑制豆蔻酰转移酶活性的抑制肽噬菌体所展示的随机区１５肽序列ＴＷＰＶＶＨＧＡＣＲＡＨＧＨＣ进行关键氨基酸残基的单点,双点和缺失等一系列突变研究,以确定其功能区段。结果显示;Ｗ２Ａ,Ｈ６Ｎ和Ｈ６Ｒ突变抑制活性明显下降,Ｐ３Ａ,Ｖ４Ｖ５→Ｖ４Ａ５双点突变对活性也有一定的影响,而Ｖ４Ｖ５→Ｗ４Ｗ５,Ｈ１２Ｎ,Ｈ１４Ｎ,Ｃ９Ｓ,Ｃ１５Ｓ,ΔＣ１５,ΔＨ１４Ｃ１５和Δ９－Ｃ１５等突变对则基本上     

用定点诱变技术鉴定蛇毒解联蛋白RGD侧翼氨基酸残基的结构和功能

为了证实蛇毒蛋白RGD侧翼氨基酸残基对ADP诱导的血小板凝聚抑制作用的重要性,分析了RGD环上游氨基酸残基对解联蛋白活性的影响。将位于两种角联蛋白蝮蛇毒素（kistrin）和华丽蛇毒素(elegantin）之间的氨基酸残基和RGD环内的氨基酸残基进行杂交。用定点诱变技术奖elegantin一级结构骨的KKKR^44T^45I^46／A^50RGDN^54P^55分别突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55和 SKAG^44I^46/P^50RGDM^54P^55,这些序列和kistrin中相应的序列S^39RAGT^43/A^50RGDN^54P^55有相似之处,序列由KKKR^44T^45I^46/A^50RGDN^54P^55突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55,显著地降低了elegantin对血小 板凝聚的抑制因子的活性,而T^45的缺人（KKKR^44T^45I^46/A^50RGDN^54P^55突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55）支增强了elegantin对血小板凝聚的抑制作用,进一步研究证明它们的电泳特性是不同的。表明降RGD模体上游39－45倍的氨基酸与RGD侧翼氨基酸残基序列对解联蛋白的结构和功能具有重要作用。     

凝乳酶原（凝乳酶）二硫键Ｃys206—Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Ｃys206-Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为－１６．１kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的ＤＮＡ,采用快退火可解决此矛盾。５个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除Ｃ２０６Ａ外,约占细胞总蛋白的５０％左右,突变的复性结果表明,Ｃys206-Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在５个突变体中,Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ的复性率分别为Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ、Ｃ２１０Ａ、Ｃ２１０Ｓ的４．５倍、２０倍和３０倍,而C206A不能复性。Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ与Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ的远紫外ＣＤ光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加由于上述３个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

Functional Analysis of Conserved Histidines in Choline Acetyltransferase by Site-Directed Mutagenesis

Abstract: The choline acetyltransferase (ChAT) reaction involves the transfer of the acetyl group of acetyl-CoA to choline, in which an active site histidine is believed to act as a general acid/base catalyst. A comparison of the deduced amino acid sequences of the enzyme from Drosophila , pig, rat, and Caernohabditis elegans revealed three conserved histidines: Drosophila His²⁶⁸, His³⁹³, and His⁴²⁶. Each of these histidines was replaced by a leucine and a glutamine, and the kinetic properties of each of the recombinant mutant enzymes were determined. The mutations yielded active His²⁶⁸Leu-ChAT, His^Z68Gln-ChAT, and His³⁹³Gln-ChAT and inactive His³⁹³Leu-ChAT, His⁴²⁶Leu- ChAT, and His⁴²⁶Gln-ChAT. The kinetic constants K_m(CoA), K_{m(acetyloholine)}. and V_max were essentially the same for all of the active mutants. When the integrity of the CoASAc binding site was investigated in the inactive mutants, the data suggested that the binding site in His³⁹³Leu-ChAT is disrupted but conserved in His⁴²⁶Leu-ChAT and His⁴²⁶Gln- ChAT. These results suggest that His⁴²⁶ is an essential catalytic residue and could serve as an acid/base catalyst.     

丁酰胆碱酯酶结构研究新进展

丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase, BChE, EC 3.1.1.8),能与有机磷毒剂或杀虫剂结合,并能水解许多酯类、肽类及酰胺类化合物,对这些化合物的中毒具有防治作用.近年来通过计算机模拟技术及定点突变技术对其结构研究取得了重要进展,对人BChE外周阴离子部位的结构有了新的认识, 并通过氨基酸替换使BChE获得了水解有机磷酸酐的新功能.     

Synthesis of Recombinant P48 of Mycoplasma agalactiae by Site Directed Mutagenesis and its Immunological Characterization

Contagious agalactia caused by Mycoplasma agalactiae is an economically important disease of sheep and goats and has been prevalent worldwide including India. The present study was undertaken to evaluate the membrane protein P48 of M. agalactiae for specific diagnosis of disease. For this, p48 gene of the organism was amplified by PCR and subjected to site directed mutagenesis to convert three TGA codons to TGG’s and, subsequently, cloned into prokaryotic expression vector pPRO EX HTb. Purified recombinant P48 protein reacted to anti-P48 serum in western blotting, which confirmed its immunogenic nature. Furthermore, the immune-blotting of the cell lysates from various Indian isolates of M. agalactiae against anti-P48 serum resulted in a single band at ～ 48 kDa among all isolates, indicating the conserved nature of P48 antigen in M. agalactiae. Also, the cross reactivity of P48 antigen among various Mycoplasma spp. was checked by western blotting which revealed reactivity only with M. agalactiae and M. bovis. Hence, this antigen could be exploited to differentiate M. agalactiae from other pathogenic Mycoplasma species except M. bovis. However, the inability of P48 to distinguish M. agalactiae from M. bovis does not downgrade the significance of P48 as the two species are usually host specific.     

用改进的重叠PCR引入血管内皮生长因子基因突变

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的PCR产物克隆于T载体上,经转化JM109感受态菌株后,随机挑取8个白斑菌落,混合后制成混合模板.采用3条引物,做两轮重叠PCR反应,获得了VEGF的突变基因,经PCR鉴定,酶切鉴定和测序分析表明所得基因为目的产物.实践证明这种突变方法简单快速,为下一步实验大量引入突变奠定了实验基础.     

Site-Directed Mutagenesis of Active Site Residues Reveals Plasticity of Human Butyrylcholinesterase in Substrate and Inhibitor Interactions

Abstract: In search of the molecular mechanisms underlying the broad substrate and inhibitor specificities of butyrylcholinesterase (BuChE), we employed site-directed mutagenesis to modify the catalytic triad residue Ser¹⁹⁸, the acyl pocket Leu²⁸⁶ and adjacent Phe³²⁹ residues, and Met⁴³⁷ and Tyr⁴⁴⁰ located near the choline binding site. Mutant proteins were produced in microinjected Xenopus oocytes, and K_m values towards butyrylthiocholine and IC₅₀ values for the organophosphates diisopropylfluorophosphonate (DFP), diethoxyphosphinylthiocholine iodide (echothiophate), and tetraisopropylpyrophosphoramide (iso-OMPA) were determined. Substitution of Ser¹⁹⁸ by cysteine and Met⁴³⁷ by aspartate nearly abolished activity, and other mutations of Ser¹⁹⁸ completely abolished it. Tyr⁴⁴⁰ and Leu²⁸⁶ mutants remained active, but with higher K_m and IC₅₀ values. Rates of inhibition by DFP were roughly parallel to IC₅₀ values for several Leu²⁸⁶ mutants. Both K_m and IC₅₀ values increased for Leu²⁸⁶ mutants in the order Asp < Gln < Lys. In contrast, cysteine, leucine, and glutamine mutants of Phe³²⁹ displayed unmodified K_m values toward butyrylthiocholine, but up to 10-fold decreased IC₅₀ values for DFP, iso-OMPA, and echothiophate. These findings add Tyr⁴⁴⁰ and Phe³²⁹ to the list of residues interacting with substrate and ligands, demonstrate plasticity in the active site region of BuChE, and foreshadow the design of recombinant BuChEs with tailored scavenging properties.     

通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性

纳豆激酶（Nattokinase, NK）是一种纤溶酶，可溶解血栓，常用于治疗心血管疾病（CVDs）。然而，野生型NK往往表现出很少的纤溶能力和较低的热稳定性，针对如何提高NK的热稳定性和活性开展研究。使用重叠延伸PCR法将NK中位于194位的Ser替换为Pro，为验证突变后的热稳定性，将野生型NK和突变体S194P均在不同温度下孵育相同时间，使用纤维蛋白板法测定二者酶活，验证热稳定性。成功构建了pET-26b-NK_S194P，测量酶活结果显示，野生型NK和突变体S194P酶活分别达到101.30 IU/mL和123.23 IU/mL，结果表明突变体S194P的酶活比野生型NK高（18.10±2）%，将野生型NK和突变体S194P在60~65 ℃温度下孵育30 min后测量酶活，野生型NK在63 ℃时丧失酶活，突变体S194P在65 ℃时丧失酶活，耐热温度提高2 ℃。结果表明，突变体S194p的蛋白结构在突变后发生了改变，使NK提高了耐热温度。