棉酚抗生育新机制——对磷脂酶A_2活力的抑制作用(英文)

 采用微孔比色法及荧光分析法 ,研究抗男性生育化合物棉酚与猪胰腺磷脂酶A2 (phospho lipaseA2 ,PLA2 ,EC3 1 1 4 )温育并透析前后对酶活力及荧光的影响 .结果表明 ,棉酚与PLA2 不可逆地结合明显地降低了PLA2 活力及荧光强度 .棉酚对酶活力抑制作用的IC50 为 35μmol L ;当其浓度达到 80 μmol L时 ,能够完全抑制PLA2 ( 4 11μmol L)对合成底物 2 硫代十六酰乙基磷酸胆碱(HEPC ,0 .2 5mmol L)的水解作用 .PLA2 的最大激发波长与发射波长分别为 2 75nm ,34 3nm ,荧光强度与酶浓度呈良好的线性关系 .棉酚对PLA2 的荧光具有较强的淬灭作用 .由于PLA2 与男性生育密切相关 ,棉酚对PLA2 活力的影响可能是其避孕作用及伴随的副作用的一种新的重要机制     

江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A_2的荧光光谱学研究

用荧光光谱方法研究了江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A_2(NPLA_2).研究结果表明NPLA_2分子中确实含有一个色氨酸残基.且位于NPLA_2分子表面;我们还发现荧光探针bis-ANS在NPLA_2分子上有一结合区,其解离平衡常数为11.6μmol/L ;利用结合了的bis-ANS与NPLA_2分子中色氨酸残基之间的能量传递计算出两者之间的距离为17.7(?).     

中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在大肠杆菌中的表达(英文)

将中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AcPLA2)蛋白成熟肽编码区基因(405 bp)克隆至表达载体pETBlue-1,在大肠杆菌Tuner(DE3)plac I中诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,表达产物分子量为15kD,约占细菌总蛋白的4.6％;用意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)纯品制备的兔源多克隆抗体为一抗作Western blot,表达产物显示类似于天然纯AmPLA2的特异性印迹,证实AcPLA2基因已在大肠杆菌中得到表达。     

醋酸棉酚对褐家鼠抗生育作用的研究

1.用30毫克/公斤·日和50毫克/公斤·日棉酚饲喂褐家鼠6周,合笼交配结果表明,不仅雄性产生不育,雌性也产生不孕。 2.形态学观察,与对照组相比,棉酚主要损伤曲细精小管内精子、精子细胞和精母细胞,同时管壁萎缩、变形并明显变薄。雌性卵巢重量有所下降,形态基本正常,但子宫粘膜萎缩变薄,腺体数目显著减少。 3.由器官系数测定可知,50毫克组的雄雌褐家鼠与对照组相比,除雄性肾上腺外,其它器官都有明显的差异。     

江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A_2的荧光光谱学研究

用荧光光谱方法研究了江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A_2(NPLA_2).研究结果表明NPLA_2分子中确实含有一个色氨酸残基.且位于NPLA_2分子表面;我们还发现荧光探针bis-ANS在NPLA_2分子上有一结合区,其解离平衡常数为11.6μmol/L ;利用结合了的bis-ANS与NPLA_2分子中色氨酸残基之间的能量传递计算出两者之间的距离为17.7(?).     

广西眼镜蛇蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

目的对广西眼镜蛇毒中磷脂酶A2(PLA2)进行分离纯化,测定其对肝星状细胞HSC-T6的增殖抑制作用。方法采用Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱结合的方法分离广西眼镜蛇粗毒,经平板法测定各峰的PLA2活性;经SDS-PAGE电泳鉴定终产物纯度并测定分子量,NanoLC-ESI-MS/MS鉴定其组分;CCK-8法测定PLA2对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,确定其凋亡的最小毒性浓度。结果 Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱层析法,得到第Ⅲ峰具PLA2活性,且达到电泳纯,经NanoLCESI-MS/MS鉴定其为PLA2,分子量约为14.06kD;PLA2在0~1μg/ml的浓度下对HSC-T6细胞具有一定的促增殖作用,2μg/ml时细胞数达到最大值,4~16μg/ml时对细胞生长有抑制作用,且随浓度增大细胞数降低。结论采用Sephadex G-50、CM-Sepharose CL-6B、Macro-prep High S预装柱结合的方法对广西眼镜蛇毒进行分离纯化,得到电泳纯且具PLA2活性的磷脂酶A2;广西眼镜蛇毒PLA2对肝星状细胞HSC-T6增殖有抑制作用,PLA2对HSC-T6细胞的最小毒性浓度为2μg/ml。     

钙离子对江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2结构与功能的影响

钙离子在江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ_２中的作用是多方面的。它不仅能够引起酸性磷脂酶Ａ_２在溶液中构象的变化,而且对该酶活性有较大的影响。Ｃａ~（２＋）为酶活力所必需,当Ｃａ~（２＋）浓度达到０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ时,酶表现出很高的活力;Ｃａ~（２＋）浓度超过０．５ｍｍｏｌ／Ｌ时,催化反应出现一个明显的延滞期。化学修饰表明Ｈｉｓ_（４７）在表现活力方面起重要作用,Ｃａ~（２＋）的存在可降低其修饰反应的速度,提示这是由于Ｃａ~（２＋）引起构象发生变化而造成的。     

日本蝮蛇蛇毒磷脂酶A2(Gln49-PLA2)的细胞毒性

从日本蝮蛇(Agkistrodonblomhoffiiussurens)蛇毒中分离得到PLA2同源物Gln49PLA2,该蛋白具有抗凝血活性、肌肉毒性,缺乏磷脂酶A2活性。分析了该蛋白质对不同培养细胞生长的影响,探讨其细胞毒性。结果表明:贴壁细胞的Gln49PLA2半致死量(LD50)明显低于悬浮细胞,肝素可以明显抑制Gln49PLA2的细胞毒性。将其作用于K562细胞,随着Gln49PLA2用量的增加乳酸脱氢酶(LDH)释放量增加,细胞凋亡率增大,线粒体膜电位下降,但Bcl2蛋白的表达量无明显变化。     

金属离子对湖南产五步蛇蛇毒磷脂酶A2活性的影响

测定结果示,对湖南产五步蛇蛇毒磷脂酶Ａ２,Ｋ＋可使酶活性增加,而Ｆｅ３＋等则不同程度地抑制酶活性     

广西眼镜蛇毒磷脂酶A2初步晶体学分析

广西眼镜蛇毒酸性磷脂酶A2具有抗凝血活性和溶血活性。采用悬滴气相扩散法,培养出该酶四方和立方两种晶型的单晶,并进行了X射线衍射鉴定。四方晶型的空间群为P43212或P41212,晶胞参数为α=b=8.797nm,c=10.831nm。每不对称单位中含3个分子;立方晶型的空间群为P213,晶胞参数为a=b=c=6.840nm,其不对称单位含1个分子,对两种晶型分别收集了0.28nm分辨率衍射数据。对不同地域眼镜蛇毒磷脂酶A2的晶体特性进行了比较。     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A2的新晶型结构

从尖吻蝮蛇毒中分离出一种酸性磷脂酶A2 ,得到了一种新的晶型。用分子置换法测定其晶体结构 ,结构的分辨率达到 0 .2 8nm。该结构给出 2 1.9%的晶体学R因子 (R free =2 5 .7% )和合理的立体化学参数。与已报道的晶型相似 ,不对称单元的两个独立分子形成二体 ,揭示了这种二体的稳定性。二体的形成过程也伴随着 14～ 2 3肽段显著的构象变化 ,这一肽段属于磷脂酶A2 的界面识别部位。氨基酸序列分析表明 ,带正电荷的 34位残基是所有第二类具有溶血活性磷脂酶A2 的共同特点。NaCl对晶体的堆积具有显著的影响 ,从而导致晶胞参数的明显改变。与已报道的晶型不同 ,在酶分子的疏水通道内观测到了 2 甲基 2 ,4戊二醇 (2 methyl 2 ,4 pentanediol,MPD)分子     

尖吻蝮蛇酸性磷脂酶A2的纯化和初步晶体学

为进一步揭示影响血小板聚集活性的结构基础,纯化了江西尖吻蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒａｄｕｎ ａｃｕｔｕｓ）酸性磷脂酶Ａ２。江西省吻蝮蛇蛇毒经ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析,两步ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析以及Ｍｏｎｏ）ＧＦＰＬ离子交换柱层析,得到了ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳和等和集电泳均一的磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）,其分子量为１６．５ＫＤ,等电点为４．３,经测定,该酶具有抑制ＡＤＰ诱地     

Phospholipase A2 activity in the fat body of the tobacco hornworm Manduca sexta

We report on phospholipase A₂ (PLA₂) activity in homogenates prepared from fat bodies of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLA₂ activity is responsible for hydrolyzing fatty acids from the sn-2 position of phospholipids. The rate of hydrolysis increased with increasing homogenate protein concentration up to ～? 320 μg protein/ml reaction volume. Higher protein concentrations did not appreciably increase the rate of PLA₂ activity. As seen in some, but not all PLA₂s from mammalian sources, hydrolyzing activity increased linearly with time. The fat body activity was sensitive to pH (optimal activity at pH 8–9) and temperature (optimal activity at ～?40°C). The activity was associated with fat body rather than hemolymph, because no activity was detected in cell-free serum. The fat body PLA₂ activity differs from the majority of PLA₂s with respect to calcium requirements. Whereas most PLA₂s are calcium-independent. A few others are known to require submicromolar calcium concentrations. The fat body activity appears to be calcium independent. These data show that a PLA₂ activity that can hydrolyze arachidonic acid from the sn-2 position of phospholipids is associated with the tobacco hornworm fat body. The biological significance of this activity relates to biosynthesis of eicosanoids. Pharmacological inhibition of PLA₂ impairs the ability of this insect to respond to bacterial infections. Since the impairment can be reversed by treatment with exogenous arachidonic acid, the PLA₂ activity may be an important step in eicosanoid biosynthesis. © 1993 Wiley-Liss, Inc.     

尖吻蝮蛇毒磷脂酶A2基因的克隆与序列分析

从尖吻蝮蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,经ＲＴＰＣＲ扩增磷脂酶Ａ２的基因,以江浙蝮蛇的酸性磷脂酶Ａ２基因为探针杂交筛选克隆,分离得到４种磷脂酶Ａ２基因。经双向测序测定了这些磷脂酶Ａ２同功酶基因的全序列,并由此推导出编码的氨基酸序列。运用计算机软件推算了它们的等电点,按照等电点和结构特征将它们分别命名为尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２Ｉ（Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ）、尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶Ａ２ＩＩ（Ａ．ａＡＰＬＡ２ＩＩ）、尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶Ａ２（Ａ．ａＢＰＬＡ２）和尖吻蝮蛇毒Ｌｙｓ４９磷脂酶Ａ２（Ａ．ａＬｙｓ４９ＰＬＡ２）。其中Ａ．ａＡＰＬＡ２Ｉ的１～１０位氨基酸残基序列同以前分离得到的尖吻蝮蛇酸性磷脂酶Ａ２已测定的１～１０位氨基酸残基序列完全一致。Ａ．ａＬｙｓ４９ＰＬＡ２基因则由于其推导出的４９位氨基酸残基由Ｌｙｓ代替了Ａｓｐ而区别于以前克隆到的磷脂酶Ａ２基因。最后运用计算机软件比较了它们的同源性。这一组磷脂酶Ａ２基因的克隆,将为进一步研究磷脂酶Ａ２的结构与功能的关系提供更多的信息。     

精子顶体反应期间磷脂酶A2的信号转导及其调节

磷脂酶A2是精子重要的脂解酶类,包括多种不同亚型。在精子顶体反应期间磷脂酶A2受天然激动剂卵透明带、孕酮和γ-氨基丁酸激活,引起胞外Ca2 内流,使磷脂水解为花生四烯酸和溶血磷脂酰胆碱,从而促进膜的融合即顶体反应。天然激动剂引起PLA2激活受Gi蛋白、甘油二酯、蛋白激酶A、蛋白激酶C、促分裂原蛋白激酶和活性氧等多条信号通路的调节,此外,磷脂酶A2与特异性磷酯酶C之间可以发生信号串话。研究PLA2的信号通路为了解受精机制、男性不育之病因和开发男性避孕药提供依据。     

长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2的分离和初步表征

东北长白山白眉蝮蛇（ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｂｌｏｍｈｏｆｆｉＵｓｕｒｅｎｓｉｓ）蛇毒经ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０离子交换层析柱,连续３步ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５凝胶过滤柱得到了磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）的纯品。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）以及基质辅助激光解析电离飞行时质谱（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳ）表征为单一蛋白,其准确分子量为（１４．００８±０．００７）ｋＤ。最适ｐＨ范围８．０～９．０,最适的反应温度为４５℃。在溶液中有多聚体的存在。