巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因在枯草杆菌中的高表达

用ＰＣＲ方法从巨大芽孢杆菌的基因组ＤＮＡ中扩增到青霉素Ｇ酰化酶基因,并装载到枯草杆菌质粒ｐＰＺＷ１０３中,将其转化到枯草杆菌ＤＢ１０４中进行了分泌表达,重组菌株产酶无需苯乙酸诱导。在３７℃培养２４ｈ,菌液酶活力可达６ｕ／ｍｌ。１０天的连续传代实验表明重组菌株的稳定性很高。     

巨大芽孢杆菌BP931胞外青霉素G酰化酶的产生条件

研究了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BP 931胞外青霉素G酰化酶的产生条件。菌在由葡萄糖0.7％,氮源1号0.5％,酵母膏1.0％和苯乙酸0.8％组成的液体培养基(灭菌前pH9.0,灭菌后pH8.0)中,28℃振荡培养44h。以6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸为底物,培养滤液酶活力为9.0IU/ml。诱导物苯乙酸于培养6h后加入,酶活力可以提高到11.0IU/ml。Ca²⁺、Al³⁺、Sn³⁺、Mn²⁺和Fe²⁺离子降低酶的形成;Cu⁺和C0²⁺离子显著抑制菌生长,降低酶的形成;Zn²⁺,Cd²⁺和Hg²⁺离子完全抑制菌生长和酶形成。     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其性质

利用PCR技术克隆了粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis,CICCAS1.76 7)青霉素G酰化酶 (pencillinGacylase ,PGA)基因 (GenBank登录号AF4 5 5 35 6 )。通过构建工程菌E .coli(pETAPGA) ,该酶在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物分泌到周质空间。进一步构建的工程菌B .subtilis (pMAPGA)和B .subtilis(pBAPGA)实现了该酶的胞外分泌表达。分泌表达的最高表达量为 6 5 3u/L ,比野生型A .faecalis表达量高 10 9倍。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE SepharoseCL 6B两步纯化 ,纯度提高 86倍 ,活力回收率达到 81% ,纯化后的PGA活力为 1.4 6 9u/mg。研究表明 ,PGA家族成员中只有粪产碱杆菌PGA和巨大芽孢杆菌PGA可以在枯草芽孢杆菌中分泌表达。与巨大芽孢杆菌PGA相比 ,粪产碱杆菌PGA的最适pH值为 8.0 ,最适温度为 6 0°C ,而且在有机溶剂中具有更强的稳定性。该酶在水相中具有较低的头孢氨苄合成活力。本研究为粪产碱杆菌PGA的获得提供了新的途径。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因的克隆和表达

我们分离到了一株产生分泌型青霉素G酰化酶的巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriumBM1)。用pBR322作载体,将该菌的青霉索G酰化酶基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coliMcl061)中,得到含有9．9kb插人片段的重组质粒pBmPA4。分析了该质粒的限制酶酶切图谱,并经体外缺失获得含4．9kb插入片段的质粒pBmPA5。pBmPA4和pBmPA5在E·coliMcl061中均能表达,表达受苯乙酸诱导。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的定点突变及其动力学性质研究

为了提高青霉素G酰化酶（PGA）在酸性及有机溶剂中的稳定性,以大肠杆菌的晶体结构为模板,用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构结构并且选择PGA分子表面的合适碱性氨基酸突变为丙氨酸,通过三种不同的快速PCR介导定位突变的方法,将位于PGA的α亚基21位、128位和β亚基492位、512位的赖氨酸残基分别突变为丙氨酸,获得四个突变酶Kα021A、Kα128A、Kβ492A和Kβ512A。其中Kα128A和Kβ512A保持与野生型相近的酶活力,其动力学性质如最适温度、最适pH,Km及Kcat没有明显变化;突变酶Kα021A和Kβ492A则丧失 了酶活力。上述结果表明,PGA分子表面非活性中心的赖氨酸→丙氨酸点突变使突变子的性状发生了分化,突变效应呈现出丰富的多样性。该有理设计不但可以提高酶的稳定性,而且为揭示PGA结构和功能的关系提供了一个新的研究模型。     

巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆 …

从巨大芽孢杆菌ＣＡ４０９８的基因组中,通过ＰＣＲ方法扩增青霉素酰化酶（ｐｇａ）基因,克隆到ｐＫＫ２２３－３质粒中,在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中得到表达。同时,测定了ｐｇａ基因的全部序列,推出氨基酸序列,再与不同菌种来源的青霉素酰化酶的氨基酸序列进行比较,表明它们的序列有一定的保守性,尤其是活性部位的保守性更强。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶在新型环氧载体ZH-HA上的固定化

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶共价结合在新型环氧-氨基型载体ZH-HA 上,通过对酶浓度、固定化时间、pH以及缓冲液浓度等条件的考察,确定了最优固定化条件:50 mg比活力6000 U/g的巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶蛋白和1g ZH-HA悬浮于pH 9.01 mol/L磷酸缓冲液,室温搅拌6 h,制得固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶,活力2126 U/g湿载体,活力回收率7.67%.比较研究了固定化酶与原酶性质,原酶最适温度45℃,最适pH为8.0.固定化酶则分别是50℃和9.0,分别比溶液酶偏移5℃、1.0个pH单位.经过40批连续水解青霉素G钾盐,固定化巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶仍保持80%的活力,显示出良好的工作稳定性.     

聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶合成头孢氨苄的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚丙烯腈纤维的衍生物上。制成的丝状固定化青霉素酰化酶表现活力达 1 5 3U g(湿重 )。固定化酶合成头孢氨苄的最适pH为 6 5 ,最适温度为 40℃。 7 ADCA的投料浓度以 4%为好 ,7 ADCA与PGME的投料量比率为1∶2 ,最佳用酶量为 1 70U g 7 ADCA。在pH6 5、温度 3 0℃时 ,固定化酶对 7 ADCA的表观米氏常数K7 ADCA为 0 1 6 2mol L ,对PGME的表观米氏常数KPGME为 0 3 6 4mol L ,最大反应速度Vmax为0 0 4 6 2mol·L- 1·min- 1,用固定化酶合成头孢氨苄 ,使用 5 0次保留酶活力 83 9%