m RNA5′端不同位置的二级结构对原核生物翻译起始的影响

 一个 2 1 bp的序列插入 B50中的人 PCNA- Lac Z′融合蛋白 m RNA的 SD序列的上游 1 1 bpH ind 切点处 ,构成正、反向插入的两个重组质粒 B50 il、B50 i2 .通过计算机程序对 m RNA二级结构的模拟分析 ,B50 il的插入序列在翻译起始区 (TIR)前形成一个发夹结构 ,但不影响 TIR的二级结构 ;B50 i2的插入序列在 TIR 5′端形成一个二级结构 ;而另一克隆 D1 3与 B50因 SD前后的 6个和 7个碱基序列的不同 ;使翻译起始区 TIR的 SD到 AUG附近的二级结构不相同 .实验测定的四者的β-半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开 m RNA TIR的二级结构所需能量ΔE进行比较 ,其结果说明 m RNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响 ,而位于 TIR的 5′端的二级结构对翻译起始效率是有影响的 .不过 ,它与 m RNA TIR的 SD到 AUG的附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比 ,TIR5′端二级结构的影响比较小 .同时 ,PCNA- Lac Z和 PCNA- Lac Z′两种融合蛋白的β-半乳糖苷酶活性也进行了比较 ,酶活性有差别 ,但不同质粒酶活性的比值仍相同 .     

一种优化翻译起始效率的方法

本文以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因作为目的基因,把包括PCNA基因5′端非翻译区(5′NTR)的24bp和编码38个氨基酸114 bp的顺序插入pTZ19R,构建与LacZ’5′端的融合基因。用寡核苷酸定点突变法在PCNA 5′NTR形成SD顺序,再用PCR法在SD顺序左右两侧分别随机突变6个和7个碱基,使它们与结构基因5′端顺序自发地形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化JM109(DE3),以T7 RNA聚合酶-T7启动子调控转录。对288个重组子的β-gal活性测定表明,不同重组的表达量可相差55倍,其中9个表达量不同的重组子的RNA dot blot证实它们在转录水平无明显表达差异。由此提示,该研究策略和方法能有效地改变目的基因的TIR二级结构和捕获具有高翻译起始效率的表达克隆。     

mRNA翻译起始区构效关系的研究

本文分析了9个表达量相差55倍的5′PCNA-LacZ′重组子的TIR二级结构与翻译起始效率的关系。在5′NTR顺序确定为28个核苷酸(从转录起始位点起)时,TIR范围在约编码第12个密码子(第33至37核苷酸)处存在一个二级结构及其△G的变化阈位,在该阈位处按表达量调正重组子TIR的范围,得到△G与表达量之间相关系数为0.97的曲线;在TIR二级结构中,起始密码子处于配对的空间位置对翻译起始效率有明显抑制作用,但SD顺序的空间位置与表达量之间无明显相关性。     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５′端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ′的５′端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用ＰＣＲ法在ＳＤ顺序两侧,即ＳＤ上游６个碱基和ＳＤ与ＡＵＧ之间７个碱基,进行随机突变,它们与结构基因５′端序列形成各种可能的翻译起始区（ＴＩＲ）二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）,５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′ｍＲＮＡ可通过诱导表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在Ｘ－ｇａｌ板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到２６９个５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′融合质粒。从中选择８个不同蓝色的重组子进行β－ｇａｌ活性测定,结果表明它们的酶活性相差在２０倍以上。而ＲＮＡ点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。     

基于mRNA 5'端TIR区二级结构优化提高重组sTNFαRI在大肠杆菌中的表达水平

目的:通过优化PET11b-s TNFαRI 5'mRNA翻译起始区(TIR)二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体(sTNFαRI)在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中的表达水平。方法:通过对PET11b-s TNFαRI mRNA 5'端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析,设计相应的引物对mRNA 5'翻译起始区(TIR)相应密码子进行突变,从而使核糖体结合位点(RBS)及起始密码子(AUG)暴露于发夹结构之外,此外将p ET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA,以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5'端TIR区优化后的序列与s TNFαRI序列一起克隆到p ET11b载体中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性转化子经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测。结果:通过对PET11b-s TNFαRI 5'TIR mRNA二级结构优化,经SDS-PAGE和Western blot分析表明重组s TNFαRI的表达水平较优化前提高50%~60%。结论:通过对重组载体翻译起始区(TIR)mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平,对进一步工业化生产具有重要的应用价值。     

翻译起始区二级结构对荧光素酶基因在COS-7细胞中表达效率的影响

在荧光素酶基因起始密码子ATG下游插入4种串连重复的密码子(6×ATT ,3×ATT ,6×GCC与3×GCC) ,得到具有不同二级结构的翻译起始区(translationinitiationregion ,TIR) ,以研究TIR二级结构对该基因在COS 7细胞中表达的影响.Northern印迹结果显示,4种重组子mRNA的转录水平没有显著差异,而Western印迹与酶活性检测表明,与野生型结构相比,6×ATT与3×ATT能显著提高荧光素酶的表达量与活性,而6×GCC结构的表达量明显下降.使用计算机辅助分析软件,扫描上述TIR结构发现,TIR稳定性或二级结构复杂度是导致上述表达差异的主要原因.     

原核表达中优化起始密码下游序列的软件设计与实现

在原核表达中影响外源基因表达效率的因素有很多,这其中翻译起始效率起了非常重要的作用。翻译起始效率又主要受SD序列、SD序列与起始密码子之间的间距、DB(DownstreamBox)序列、mRNA翻译起始区(TIR)的二级结构和稀有密码子等因素的影响。主要针对DB序列和5′端稀有密码子的优化设计了软件。通过计算机对序列进行分析比对后,按照匹配碱基数、匹配位置、密码子使用频率平均值的顺序进行排序,给出一些优化序列,并给出了软件算法。     

5'UTR中AUG的分布及其对翻译起始的影响

以细菌和古菌基因组5’UTR序列作为研究对象,分析在5’UTR的3个不同阅读框架中三联体AUG的分布,发现无论是细菌还是古菌基因组都在阅读框1中有非常明显的AUG缺失（depletion）。AUG的缺失表明在起始密码子上游的AUG很可能会对基因的翻译起始产生影响。分析得知：绝大部分的AUG都是以uORF（upstream open readingframe）的形式出现的,uAUG（upstreamAUG）的数量很少,特别是在阅读框1中,而且在细菌基因组的阅读框1中uAUG较多地出现在了含有SD序列的基因上游。比较发现,uAUG引导的序列在同义密码子使用上的偏好性较真正的编码序列差,这可能表明细菌和古菌在同义密码子使用上的偏好性也是决定基因准确地翻译起始的重要因素之一。     

5’UTR中AUG的分布及其对翻译起始的影响

以细菌和古菌基因组5′ UTR序列作为研究对象,分析在5′ UTR 的3个不同阅读框架中三联体AUG的分布,发现无论是细菌还是古菌基因组都在阅读框1中有非常明显的AUG缺失(depletion)。AUG的缺失表明在起始密码子上游的AUG很可能会对基因的翻译起始产生影响。分析得知：绝大部分的AUG都是以uORF(upstream open reading frame)的形式出现的,uAUG(upstream AUG)的数量很少,特别是在阅读框1中,而且在细菌基因组的阅读框1中uAUG较多地出现在了含有SD序列的基因上游。比较发现,uAUG引导的序列在同义密码子使用上的偏好性较真正的编码序列差,这可能表明细菌和古菌在同义密码子使用上的偏好性也是决定基因准确地翻译起始的重要因素之一。     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略 …

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５＇端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ＇的５＇端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的－８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,     

mRNA翻译起始区二级结构改变对干扰素基因在大肠杆菌中翻译的影响

为研究mRNA翻译起始区结构与基因表达的关系,利用密码子的简并性,在不改变表达产物氨基酸序列的前提下定点突变α8干扰素及αA干扰素衍生物基因的5′端若干位点,使其与表达载体重组后转录形成的mRNA翻译起始区结构发生改变。SDS-PAGE及活性测定证实这些改变提高了外源基因的表达水平。RNA斑点印迹表明突变前后基因转录水平差别不大,表达水平的提高主要由于翻译效率的提高。mRNA翻译起始区二级结构预测提示其生成自由能(ΔG)的变化可能与表达水平的提高有关。     

使用一种新策略在大肠杆菌中高效表达hbFGF

翻译起始区（TIR）二级结构是影响翻译效率的决定性因素,同时密码子的偏好性问题也是个至关重要的方面。基于以上两点考虑,对hbFGF5‘末端35个碱基进行了改造,对其中4个位点进行了定点突变,另有4个位点进行了随机点突变。这些突变都可能造成TIR二级结构变化。这4个随机突变共有32种组合,使用RNA结构预测软件DNASIS v2.5对这32种序列分别模拟其二级结构且计算其自由能,并选取了10条自由能最高的序列。根据这10条序列,分别设计引物引入突变,克隆至表达载体pET-3c上,然后转化宿主菌E.coli,通过诱导表达纯化及生物测活等常规实验方法,最后确定有两株为高表达菌株,从某种程度上证明了用计算机辅助设计定点突变的方法来优化外源基因在E.coli中的表达是有效且很有潜力的。     

人α－肿瘤坏死因子基因的高效表达

用人工合成的α－肿瘤坏死因子(TNF—α)基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是SD序列与起始密码子ATG问距离(D)各异．计算机模拟计算出翻译起始区域(TIR)中二级结构的最小生成自由能．以(D)为6个核苷酸时最小(绝对值)。它的表达效率也最高,产物TNF—α可达菌体总蛋白的60％．密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成TNF－α基因(选用大肠杆菌偏爱的密码子)的表达效率高于sc－DNA(对部分密码子改造的半合成eDNA)．     

真核细胞中多重表达框mRNA的选择性翻译起始（英文）

扫描模型和遗漏扫描模型是真核生物m RNA翻译起始的两种主要机制,但其仍存在某些例外情况,如对具有多顺反子结构的m RNA,选择性翻译起始的发生机制目前仍不清楚.本研究基于GFP蛋白开放表达框(ORF)构建了一系列重组表达载体,用以转录在移码翻译顺序及同一翻译顺序下,AUG起始密码子处于不同序列背景,以及间隔不同距离的多顺反子结构m RNA.通过转染人Bel-7402细胞系,研究了这些多顺反子结构m RNA的翻译起始模式.结果表明,在移码翻译顺序下,多顺反子m RNA可翻译出对应的不同蛋白质,而在同一翻译顺序下,GFP蛋白表达框中的多个AUG密码子,仅有首位起始密码子可发挥作用,提示核糖体在从首位起始密码子开始翻译的同时,可能会有部分核糖体继续向下扫描并识别下游的起始密码子,而这种选择性的翻译起始效率,主要取决于密码子所处的序列背景及间隔距离等因素.     

mRNA翻译起始区的结构改变对几个外源基因翻译的影响

为观察ｍＲＮＡ翻译起始区结构与基因表达的关系,利用密码子的简并性,在不改变表达产物氨基酸序列的前提下定点突变几个外源基因的５′端若干位点,使基佤表达载体重组后转录形成的ｍＲＮＡ翻译起始区结构发生改变。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等分析证实这些改变大大提高了外源基因的表达水平,ＲＮＡｄｏｔｂｌｏｔ表明突变与非突变基因转录水平差别不大,表达水平的提高主要由于翻译效率的提高,ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测提示其生     

靠近5′端帽子的上游AUG不影响t-PA mRNA的翻译

大多数真核生物mRNA的翻译起始都符合Kozak提出的扫描学说,即40s小亚基携带相应的起始因子进入mRNA的5′末端,沿mRNA线性滑动,至第一个AUG起始密码处与60s大亚基结合,形成第一个肽键,然后进入肽链延伸阶段。本课题组所构建的重组质粒pMM 5065含人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA。序列分析证明,该质粒中t-PA起始密码子ATG的5′端序列为:AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC ATG GAT……,可见转录后t-PA mRNA起妈密码子AUG的5′端还有一个AUG三联体(即上游AUG),形成一个较长的与t-PA框架不同的阅读框     

真核细胞中多重表达框mRNA的选择性翻译起始

扫描模型和遗漏扫描模型是真核生物mRNA翻译起始的两种主要机制,但其仍存在某些例外情况,如对具有多顺反子结构的mRNA,选择性翻译起始的发生机制目前仍不清楚.本研究基于GFP蛋白开放表达框(ORF)构建了一系列重组表达载体,用以转录在移码翻译顺序及同一翻译顺序下,AUG起始密码子处于不同序列背景,以及间隔不同距离的多顺反子结构mRNA.通过转染人Bel 7402细胞系,研究了这些多顺反子结构mRNA的翻译起始模式.结果表明,在移码翻译顺序下,多顺反子mRNA可翻译出对应的不同蛋白质,而在同一翻译顺序下,GFP蛋白表达框中的多个AUG密码子,仅有首位起始密码子可发挥作用,提示核糖体在从首位起始密码子开始翻译的同时,可能会有部分核糖体继续向下扫描并识别下游的起始密码子,而这种选择性的翻译起始效率,主要取决于密码子所处的序列背景及间隔距离等因素.     

eIF4A在帽依赖和IRES介导的翻译起始中的作用

生物体内翻译起始机制分为两类：帽依赖性翻译起始和内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites, IRES)介导的翻译起始。真核生物的翻译起始为经典的帽依赖性翻译起始模型,而大多数正链RNA病毒选择依赖于IRES的翻译机制。真核翻译起始因子4A (eukaryotic initiation factor 4A, eIF4A)是DEAD-box RNA解旋酶家族的成员,具有依赖于RNA的ATP酶活性和RNA解旋酶活性,而e IF4A具体的解旋机制至今仍不清晰。同时,eIF4A与其他翻译因子有着复杂而紧密的联系,在帽依赖性与IRES介导的翻译起始过程中扮演着至关重要的角色。本文主要对eIF4A的功能、结构以及eIF4A在帽依赖性与IRES介导的翻译起始过程中的机制作一综述。     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.