抗砷载体的构建及在喜温硫杆菌中的接合转移

利用DNA体外重组技术,将质粒载体pUM3上的抗砷基因片段亚克隆到含有强启动子(tae启动子)并具有广泛寄主范围特性的IncQ族质粒pMMB24上,成功构建了含有强启动子的抗砷质粒pSDRA3,以及删除调节基因片段的组成型表达的抗砷质粒pSDRA4。通过接合转移的方式将其导入专性自养极端嗜酸性的喜温硫杆菌中,首次成功地建立了喜温硫杆菌的遗传转移系统,构建了冶金工程菌T.caldus(pSDRA3)和T．caldus(pSDRA4)。与野生菌相比,重组菌抗砷性能明显提高。     

辣椒冷诱导差异表达基因分析

采用cDNA-AFLP技术分析了4℃低温诱导前后耐寒辣椒(Capsicum annuum L.)品系P70的基因表达差异谱.结果获得了120个差异片段,对阳性克隆中的12个差异片段进行测序和Blast-x比对,发现其中有4个片段(KH-1、KH-2、KH-3和KH-4)与抗逆性相关,其碱基数分别为185、160、269和511 bp,4个片段分别与编码抗坏血酸过氧化物酶基因的同源性达98%、与细胞色素p450基因的同源性达98%、与牛血清蛋白(BSA)基因的同源性达94%、与水孔通道蛋白(AQP)基因的同源性达90%.4个差异基因表达模式为:基因KH-1、KH-2、KH-3上调表达,KH-4下调表达.     

絮凝基因(FLO1G)的序列测定及分析

虽然酵母细胞絮凝的确切机制至今尚无定论 ,但已克隆了多个与絮凝相关的基因 ,如ＦＬＯ1、ＦＬＯ5、ＦＬＯ1 1等[1～3 ] 。这些基因的表达可以赋予非絮凝酵母细胞以絮凝能力。酵母细胞的絮凝特性在酿造工业、固定化酶、精细化工和物生制药等领域具有广泛的应用价值[4 ,5] 。从一株强絮凝酿酒酵母菌株中克隆到一个约 4 3ｋｂ的ＮＤＡ片段 ,酵母转化实验证明该ＤＮＡ片段能够赋予非絮凝酵母菌株以絮凝能力[6] 。本文简要报道对该ＤＮＡ片段进行序列测定和分析的结果。1　材料和方法1 .1　菌株和质粒实验所用菌株和质粒见表 1。表 1　菌株和质…     

壳寡糖诱导的烟草SKP1基因表达

壳寡糖是一种高效的植物抗性诱导剂,应用mRNA差异显示技术从经过壳寡糖诱导的枯斑三生烟草叶片中分离到了编号为5、31、37和46的4个基因片段.4个基因片段与本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)SKP1基因的mRNA同源性都达到82%,据此推断这4个片段是感病烟草品种枯斑三生烟草的SKP1基因.质粒双酶切及反向Northern分析结果表明,该基因表达在壳寡糖诱导下增强.由于SKP1基因与植物的抗病毒病相关,从而在mRNA水平上验证了壳寡糖的诱导抗性效应.     

性逆转石斑鱼性腺差异表达基因的克隆和筛选

以 17α 甲基睾丸酮 (17α MT)饲喂 2～ 4龄赤点石斑鱼 (Epinephelusakaara) ,成功地促使其性转变为具有生殖功能的雄鱼 .应用抑制性差减杂交 (SSH)技术构建了石斑鱼性反转前后性腺组织的SMARTcDNA文库及其cDNA差减文库 ,从中随机挑取 12 0 0个克隆进行了PCR和斑点杂交筛选 ,得到 12 0个差异表达cDNA片段 .挑选 71个cDNA克隆测序 ,将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较 ,发现有 5 1个cDNA片段序列无明显的同源性 ,2 0个片段与报道的基因有较高同源性 .在这 2 0个具同源性的片段中有 3个片段可能是与性别分化密切相关的重要功能基因 ,它们是钙调蛋白基因、活性蛋白激酶C受体基因和一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 .这 3个基因被分别命名为鱼钙调蛋白基因 (GenBankaccession :AY2 8136 3)、鱼活性蛋白激酶C受体基因 (GenBankaccession :AY2 8136 4)和鱼一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 (GenBankaccession :AY2 8136 5 ) .     

萝卜自交不亲和基因SLG6的CAPS标记的开发

萝卜是我国的主要蔬菜之一,其杂种优势十分明显,培育自交不亲和系是萝卜杂种优势育种的主要途径之一.本研究根据萝卜自交不亲和基因SLG6序列设计特异引物,以8个自交系为材料,其中自交不亲和系和自交亲和系各4个,扩增SLG6基因第232～711bp之间的单拷贝片段,8个材料均获得了一条480bp的特异片段.用限制性内切酶TaqⅠ对该片段进行酶切,自交不亲和系均产生约125bp和244bp的片段,其中,244bp的片段为自交不亲和系所特有,可作为SLG6基因的CAPS标记用于萝卜自交不亲和基因SLG6的检测;而自交亲和系则具有与自交不亲和系相同的125bp的片段和不同的多态性片段.     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kd杀蚊蛋白基因的克隆与鉴定

以人工合成的130kd杀虫蛋白基因的18—base序列为探针,通过SoutherD分子杂交,验证了在Bacillus thuringiensis var.israelensis 4Q5菌株75Md质粒上含有130kd杀蚊蛋白基因,并且证明了提纯的晶体蛋白具有杀蚊幼虫活性。对该质粒进行HindIII完全酶切,以pUCl8为载体,以E．Coli TG1为受体,得到四个与探针有强杂交信号的阳性克隆,其中两个(pFH2,PFH4)含有5．2kb HindIII插入片段,包含第一类130kd杀蚊蛋白基因;另两个(pFHI,pFH3)含有2．3kb HindIII插入片段,包含第二类13 0kd杀蚊蛋白基因的3'部分。pFH2和pFH4中,第一类130kd杀蚊基因的插入方位不同。     

中国人HIV辅助受体CXCR4基因的克隆及序列测定

为了获得HIV辅助受体CXCR4基因,进一步探索艾滋病(AIDS)的诊断、防治方法,采用逆转录巢式聚合酶链式反应(RT-nPCR)从中国人外周血淋巴细胞中克隆了CXCR4 cDNA基因,得到了预期的1 100bp左右的片段.将PCR产物与T载体连接,并进行了酶切反应鉴定,获得与T载体正向连接的克隆.测序结果表明克隆的片段含有一个开放性阅读框架,编码352个氨基酸残基.搜索GenBank,目标片段与M99293、XM051223、XM051224、XM051225有很高的同源性,比较结果显示克隆的片段包括完整的编码序列,含两个碱基的差异.     

蒙古冰草Actin基因片段的克隆及序列分析

旨在利用同源序列法分离蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)Actin基因同源片段,为研究其他基因在蒙古冰草中的表达和调控提供内标参照.根据禾本科植物小麦Actin基因(AB181991)的保守序列设计2对引物A4和A5,采用RT-PCR扩增蒙古冰草的Actin基因片段,分别得到656 bp和848 bp的片段,使用DNAman和DNAuser等分子生物学软件进行序列分析,将2个片段的重复序列合并后获得一段长度为962 bp的基因片段,编码237个氨基酸,将克隆的Actin基因片段命名为MwACT.该序列与其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在80%以上,其中与小麦、大麦的同源性达到94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上.     

藓类植物DNA条码的初步研究——以蔓藓科部分属为例

选取7个叶绿体基因片段,其中3个编码区基因片段（matK,rps4 and rbcL-a）和4个非编码区基因片段（atpB-rbcL,atpF-H,psbK-Iandtrn H-psbA）,一个线粒体基因片段（nad5）和一个核基因片段（ITS2）,材料包括5个属14个种的74份样品。分析比较了6个基因片段的多样性、种内和种间的遗传距离、鉴别率等。结果显示,在使用单个片段时ITS2的鉴定效果最好,而atpB-rbcL则是叶绿体基因片段中鉴别能力最高的。使用组合片段的结果发现,两个基因片段组合的鉴别效果最好。通过NJ树的方法检验,atpB-rbcL＋trn H-psbA和rbcL-a＋＋trn H-psbA的鉴定成功率是64%,当再增加一个或两个基因片段时其鉴定效果并没有提高。本研究表明在植物中应用DNA条码需要用质体基因和核基因联合。     

佛手低温胁迫相关基因的差异表达

佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)是药用及观赏价值都很高的经济植物,但它对低温反应敏感,容易发生冻害现象.因此,了解其冷敏感机制对提高抗寒性起着重要的作用.以佛手为试材,-4℃低温处理24 h后,采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和半定量RT-PCR技术,分析和鉴定与冷敏感相关的差异表达基因.DDRT结果获得差异片段121个,经生物信息学分析,差异表达序列中有33条为功能已知序列,88条为未知序列(其中5条具有开放性阅读框);半定量结果获得34个阳性基因片段,其中上调基因片段29个,下调基因片段5个.除了3个基因功能未知外,其余基因主要涉及植物防御/应激反应,细胞壁的修饰,信号转导,代谢,氨基酸转运,氧化损伤,转录和蛋白质的合成,其中与植物防御/应激反应和光合作用有关的基因可能是造成佛手寒敏感的主要原因.     

PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分

以鸭肌肉组织DNA为模板,利用PCR-mtDNA技术成功克隆出了鸭mtDNA COIII基因(GenBank Accession No.DQ655706).对所克隆的序列分析表明.其序列包括鸭细胞色素C氧化酶III(COIII)基因全序列784 bp,通过同源性分析可知,动物的线粒体DNA COIII基因是相对保守的,利用此特性设计PCR-mtDNA方法鉴别检测鸭源性成分的特异性引物;以各种动物肌肉组织及饲料DNA为模板进行PCR扩增、经反复验证筛选出只能扩增出鸭DNA的目的片段,而不能扩增出其他动物DNA片段的特异性强、稳定性好的引物P3、P4;利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226 bp,对PCR产物进行测序分析可知与已克隆的鸭mtDNA COIII基因同源性达到100%,证明了所筛选引物的准确性.通过对不同含量的DNA模板溶液进行PCR扩增的方法,对筛选出的特异性引物P3、P4进行灵敏度试验,结果分析表明灵敏度约为0.001%,证明该PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,完全可作为鉴别不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分的方法.     

差异显示法分离水稻抗稻瘟病相关基因

采用mRNA差异显示技术,分析水稻稻瘟病抗源材料“地谷”叶片受稻瘟病菌侵染前后的基因的表达差异,获得87个差异片段。对这87个差异片段进行了回收、重扩增与克隆,并对其中的81个片段进行了杂交鉴定。斑点杂交结果证实其中6个片段受稻瘟病菌诱导表达。进一步克隆测序并进行数据库比对分析表明其中一个与水稻4号染色体中一推测的苹果酸合成酶高度同源,一个与水稻11号染色体上的RPR1基因高度同源,RPR1基因具有保守的NBS-LRR结构,并与水稻防卫反应的信号传导有关;另一个与水稻第6号染色体上一推测的硫氧还蛋白高度同源,其余3个为新的cDNA片段。     

小麦拔节过程中基部茎节的基因差异表达

采用差异显示逆转录PCR(DD-RT-PCR)技术分析小麦基部茎节伸长过程中基因表达差异的结果表明,小麦拔节前和拔节后基部茎节中存在明显的基因表达差异(包括质和量的差异).从具有质的差异表达基因中挑选了4个基因进行cDNA片段(编号为WSRI～4)的克隆,测序和GenBank数据库序列同源性比对分析,结果显示,WSRI与大麦中编码Ser/Thr蛋白激酶的序列具有很高的同源性,WSR2的功能未知,WSR3高度同源于玉米中码Ty3/gypsy类Kg-座子反转录酶的序列,WSR4高度同源于小麦的端粒关联DNA.半定量RT-PCR技术分析拔节过程中克隆基因WSRl～4表达特性显示,除了WSR4以外,其余3个基因的表达模式和通过DD-RT-PCR分析所展示的差异表达趋势基本一致.     

伪狂犬病病毒宿主关闭蛋白的基因克隆及结构分析

为研究伪狂犬病病毒 (pseudorabiesvires ,PRV)UL4 1基因编码的病毒宿主关闭蛋白 (VHS)的结构与功能 ,通过PCR扩增得到含UL4 1基因完整编码区的 1174bp片段 ,将该片段克隆到表达载体pGEX KG中GST下游 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中实现了GST VHS融合蛋白的高效表达 .序列分析发现VHS蛋白具有 4个保守区 ,并且第 3个保守区与核酸内切酶结构域FEN 1(1A76 )高度同源 .PROSPECT软件预测的伪狂犬病病毒VHS蛋白三维结构中含有 10个α螺旋和 2 2个β折叠 ,与单纯疱疹病毒Ⅰ型的VHS蛋白三维结构十分相似 .     

木薯Actin基因片段的克隆及序列分析

克隆木薯Actin基因片段,为研究其他基因在木薯中的表达和调控提供内参基因.通过比较拟南芥、蓖麻和麻风树Actin基因cDNA同源区域,根据基因的保守序列设计一对简并性引物,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段,使用分子生物学软件进行分析.结果显示,获得一段大小为698 bp的基因片段,编码233个氨基酸;该基因序列与其他Actin基因核苷酸序列的同源性均在85%以上,氨基酸序列的同源性达94%以上;系统进化分析表明,木薯Actin基因与大戟科植物橡胶、麻风树及蓖麻的亲缘关系最近,与毛果杨、陆地棉及木瓜等植物Actin基因具有较高的保守性.克隆的基因片段为木薯Actin基因片段,并命名为msACT.     

4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析

根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析.序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%～99.7%之间.4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化.分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究.     

差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达

用差异显示技术研究NaHCO3胁迫下星星草(Puccinellia tenuiflora)基因的表达.经Reverse Northern检测,获得了7个差异表达的基因片段.其中,6个为胁迫后诱导表达,1个为胁迫后抑制表达.序列同源性分析表明,胁迫诱导表达的6个基因片段中,1个与钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)基因同源性较高,其余5个可能为新序列,胁迫后抑制表达的基因片段与假定的adaptor蛋白基因同源性较高.本研究为进一步研究星星草的抗盐机理奠定了基础.     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

中国汉族女性TLR7基因主要编码区的全长扩增及多态性分析

目的:扩增TLR7主要编码区外显子3(exon 3)的全长基因片段并进行基因多态性分析,筛选健康人群中TLR7基因的主要SNP位点.方法:采用酚-氯仿抽提方法从28例健康女性血样中提取基因组DNA,采用长片段扩增方法分别扩增TLR7 exon 3区的3个片段,测序、拼接后进行多态性分析.结果:采用LA-Taq酶体系成功扩增TLR7 exon 3区基因片段;经与Genbank数据库中TLR7参考序列比较,我国女性TLR7基因序列高度保守,仅出现了4个点突变,并发现1个SNP位点RS3853839,表现为GG、CG和CC三种基因型.结论:建立了TLR7编码区基因扩增方法,筛选到1个TLR7SNP位点RS3853839,可为分析TLR7多态性与多种病毒感染性疾病的关系提供参考.