羊Ⅲ型前胶原的分离纯化

目的：从山羊胎皮提纯羊Ⅲ型前胶原,以代替人Ⅲ型前胶原生产免疫试剂。方法;以山羊胎皮为原料,通过11．2％硫酸铵及10％氯化钠盐析和超速离心,DE32和DE52阴离子交换纤维素柱层析提取纯化得到羊Ⅲ型前胶原。结果：测得羊Ⅲ型前胶原分子量为468kDa。主要成分甘氨酸,羟脯氨酸和脯氨酸构成比分别为40．4％,11．7％和11．1％。与人羊Ⅲ型前胶原的交叉反应为65．89％。结论：提纯得到的羊Ⅲ型前胶原可以用于代替人Ⅲ型前胶原生产免疫检测试剂。     

Tb(Ⅲ)与Ⅱ型胶原的相互作用

提取并分离纯化了Ⅱ型胶原,研究了Ｔｂ（Ⅲ）与Ⅱ型胶原的相互作用,结果表明Ⅱ型胶原对Ｔｂ（Ⅲ）有配位作用,并能极大地增强其荧光强度．用荧光滴定法和Ｓｃａｔｃｈａｒｄ作图法确定了Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）的结合常数和结合部位数,结果表明Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）有两类结合部位．其结合部位数和结合常数分别为０．７;３．１×１０５和１．３;１．０×１０５．     

Tb（Ⅲ）与Ⅱ型胶原的相互作用

提取并分离纯化了Ⅱ型胶原,研究了Ｔｂ（Ⅲ）与Ⅱ型胶原的相互作用,结果表明Ⅱ型胶原对Ｔｂ（Ⅲ）有配位作用,并能极大地增强其荧光强度。用荧光滴定法和Ｓｃａｔｃｈａｒｄ作图法确定了Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）的结合常数和结合部位数,结果表明Ⅱ型胶原与Ｔｂ（Ⅲ）有两类结合部位,其结合部位数和结合常数分别为０．７;３．１×１０＾５和１．３;１．０×１０＾５。     

人胎盘中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的提取

胶原蛋白是重要的细胞外基质成分,约占人体蛋白总量的1/3,目前已确定的胶原至少有12种类型,各型胶原都具有一定的分子构型、基因定位及组织分布特点。胶原的提取与纯化是进行胶原免疫组织化学研究的必要步骤。本文参照国外有关文献并作适当改进,成功地从人胎盘中提取了Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白。     

川芎嗪调节自发糖尿病肾病鼠Ⅲ型前胶原表达的实验研究

目的:观察川芎嗪对自发糖尿病肾病大鼠肾小球Ⅲ型前胶原基因表达的调节.方法:将实验用6月龄SPF级GK大鼠和Wistar大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、川芎嗪治疗组.治疗16周.观察治疗后大鼠的尿素氮、_薛肌苷、内生肌苷清除率、24小时尿蛋白排泄率,免疫组化检测肾组织Ⅲ型前胶原表达.结果:①造模组大鼠均出现肾脏功能有损害②川芎嗪能改善自发糖尿病肾病大鼠基本状况,降低糖尿病大鼠的尿素氮、血肌苷、24h尿白蛋白排泄率,增加内生肌苷清除率,Ⅲ型前胶原表达显著下调.结论:川芎嗪可通过降低Ⅲ型前胶原的表达,对肾脏起保护作用.     

藏红花抗大鼠肝纤维化的实验研究

目的:观察藏红花对实验性大鼠肝纤维化的防治效果,探讨其作用机制.方法:将清洁级雄性大鼠60只随机分为正常对照组、模型对照组、复方丹参组、藏红花组.除正常对照组外,其余3组均予四氯化碳腹腔注射,复方丹参组、藏红花组分别予复方丹参、藏红花溶液灌胃,第8周末处死动物,用放射免疫法检测血清透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原和Ⅳ型胶原.肝组织切片HE、MASSON染色,显微镜下观察结果.结果:藏红花组大鼠肝纤维化病理改变较轻,血清透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原和Ⅳ型胶原水平下降,与模型对照组差异显著(P<0.05).结论:藏红花具有减少肝纤维化大鼠的胶原沉积,抗肝纤维维化作用.     

结缔组织生长因子在肺纤维化初期肺动脉中的表达

本研究观察了博莱霉素(bleomycin,BLM)诱导肺纤维化初期肺动脉压、肺动脉壁Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量以及肺动脉壁结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)免疫阳性表达和分布.用气管内一次性滴注BLM(5 mg/kg体重)的方法复制肺纤维化动物模型大鼠;用右心漂浮导管技术检测肺动脉压;用天狼星红胶原纤维特异染色和偏振光观察肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原;用免疫组织化学法检测肺动脉壁CTGF表达.结果显示:滴注BLM后第14天,大鼠肺动脉压高于对照组大鼠(P<0.05);肺动脉主干和肺内动脉壁Ⅰ、Ⅲ型胶原的染色面积大于对照组大鼠(P<0.05,P<0.01),肺动脉主干血管壁Ⅰ、Ⅲ型胶原染色面积的比值高于对照组大鼠(P<0.05);肺动脉主干和肺内动脉壁CTGF免疫染色面积均大于对照组大鼠,平均光密度也高于对照组大鼠(均P<0.05);增多的CTGF免疫阳性细胞主要分布在肺动脉的平滑肌层和内皮层.以上结果表明,在BLM致肺纤维化形成初期肺动脉高压和肺血管壁结构重塑过程中,肺动脉壁平滑肌层和内皮层CTGF表达增多,这可能是肺动脉高压维持和发展的机制之一.     

PCR标记前胶原基因探针及其检测肝星状细胞前胶原基因表达

目的：建立一种新的前胶原基因探针制备方法,并用克勤克俭 检测HSC的前胶原mRNA表达。方法：从NCBIGeneBank查询Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原基因的序列,根据基因序列用OLIGO软件设计其引物：RT-PCR扩增基因,并用不对称PCR方法和DIG-dUTP标记前胶原基因探针,用其原位杂交检测HSC前胶原基因表达。结果：用所设计的引物和RT-PCR扩增得到目的基因,制备了DIG标记的前胶原基因探针,并用其检到HSC的前胶左面的基因表达。结论：建立了一种新的、较简易的前胶原基因探针标记方法,并对其它基因探针的标记有借鉴意义。     

针对I型及Ⅲ型前胶原基因的二联核酶的构建及体外活性研究

增殖性瘢痕组织中胶原蛋白的合成显著增加从而导致胶原的过度沉积。利用核酶特异地抑制前胶原基因的表达可减少胶原蛋白的合成,为瘢痕的研究和防治提供了新的思路。为研究用核酶抑制前胶原基因表达的可能及效果,设计并构建了针对α1（I）型及α1（Ⅲ）型前胶原基因的二个单价核酶串联的二联核酶基因真核表达载体,并对其体外切割活性 进行研究。结果表明该二联核酶的切割效果明显,均能有效地切割底物,为进一步研究核酶的前胶原基因表达的抑制作用以及利用核酶防治瘢痕产生打下基础。     

缺氧和DDPH对人胚肺成纤维细胞前胶原mRNA表达的影响

用核酸原位杂交和图像分析等方法,观察直接缺氧（Ｈ）和缺氧猪肺动脉内皮细胞条件培养液（ＨＥＣＣＭ）对人胚肺成纤维细胞（ＫＭＢ１７）的前胶原ｐｒｏα１（Ⅰ）,ｐｒｏα１（Ⅲ）ｍＲＮＡ表达和抗高血压药１－（２,６－二甲基苯氧基）－２－（３,４－二甲氧基苯乙氨基）丙烷盐酸盐（ＤＤＰＨ）对此过程的影响。结果发现,Ｈ和ＨＥＣＣＭ均可使ＫＭＢ１７的两型前胶原ｍＲＮＡ表达量增高,明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）。ＤＤＰＨ对ＨＥＣＣＭ组细胞的Ⅰ,Ⅲ两型前胶原ｍＲＮＡ表达增高均有显著的抑制作用（抑制率分别为－４３．９７％和－５６．２２％）,而对Ｈ组仅抑制ｐｒｏα１（Ⅰ）前胶原ｍＲＮＡ的过量表达（－５３．５８％）。提示缺氧可直接或通过肺动脉内皮细胞的介导,促进人胚肺成纤维细胞的Ⅰ、Ⅲ两型前胶原ｍＲＮＡ表达,ＤＤＰＨ在基因转录水平上对此过程有抑制作用     

低氧促进大鼠心脏成纤维细胞DNA合成及Ⅰ、Ⅲ胶原mRNA表达

目的:研究低氧(2%氧)对成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞DNA合成及Ⅰ、Ⅲ型胶原前a肽链表达的影响.方法:分离培养成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞,采用液体闪烁计数方法检测心脏成纤维细胞的DNA合成速率,采用原位杂交技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA的表达.结果:成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞在低氧第6h、12 h时3H-TdR掺入量较常氧组显著增加,分别增加34%(P＜0.05)和36%(P＜0.01);低氧第4 h、8 h、12 h Ⅰ型胶原前α肽链mRNA表达显著高于常氧培养的细胞;低氧第2 h,Ⅲ型胶原前α肽链mRNA表达显著高于常氧培养的细胞.结论:低氧能够直接促进体外培养的成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞DNA合成和Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链表达,提示低氧对心脏成纤维细胞生长和胶原表达的直接调节可能是低氧性心肌纤维化的重要机制.     

针对Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因的二联核酶的构建及体外活性研究

增殖性瘢痕组织中胶原蛋白的合成显著增加从而导致胶原的过度沉积。利用核酶特异地抑制前胶原基因的表达可减少胶原蛋白的合成,为瘢痕的研究和防治提供了新的思路。为研究用核酶抑制前胶原基因表达的可能及效果, 设计并构建了针对α₁(Ⅰ)型及α₁(Ⅲ)型前胶原基因的二个单价核酶串联的二联核酶基因真核表达载体,并对其体外切割活性进行研究。结果表明该二联核酶的切割效果明显,均能有效地切割底物,为进一步研究核酶对前胶原基因表达的抑制作用以及利用核酶防治瘢痕产生打下基础。      

无巨核细胞条件下促血小板生成素对骨髓基质细胞纤维形成的影响

目的：观察无巨核细胞存在的条件下促血小板生成素能否刺激骨髓基质细胞纤维形成。方法：用改良Dexter培养法进行体外不同浓度促血小板生成素（TPO）作用下的基质细胞培养,在培养过程中检测基质细胞相对增殖指数,纤维连接蛋白、层粘素和Ⅳ型胶原的表达,以及Ⅲ型前胶原蛋白的合成。结果：TPO可刺激基质细胞增殖,相对增殖指数随TPO浓度增加而增强,但不随作用时间延长而增强;纤维连接素、层粘素和Ⅳ型胶原在对照组与实验组均有阳性表达,但实验组强于对照组,但阳性强度不随培养时间的延长而增强;标记的Ⅲ型前胶原蛋白平均荧光强度实验组高于对照组,差异明显,但这种作用的强弱与TPO浓度相关性不强。结论：无巨核细胞存在的条件下,TPO可直接刺激骨髓基质细胞产生细胞外基质和胶原,促进其纤维形成。     

藤茶总黄酮对肝纤维化大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的:观察藤茶总黄酮(Tengcha flavonoids,TCF)对大鼠实验性肝纤维化的治疗作用,并探讨其机制.方法:采用四氯化碳(CCL4)皮下注射制备大鼠肝纤维化模型,随机分为正常对照组、模型对照组、藤茶总黄酮(TCF)治疗组和秋水仙碱(CLC)治疗组.各组以灌胃的形式给药,采用蛋白免疫印迹分析和实时定量PCR技术检测各组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况.结果:藤茶总黄酮能明显降低实验性大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05).结论:藤茶总黄酮可通过减少肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的生成,发挥抗肝纤维化的作用.     

实验性石棉肺病变中Ⅰ型及Ⅲ型胶原基因表达的研究

以斑点杂交法测定染溫石棉尘后30天与60天大鼠肺组织中前胶原mRNA的水平,即proα_1(Ⅰ)、proα_2(Ⅰ)、proα_1(Ⅲ)mRNA的水平,并与正常大鼠肺组织对比,结果显示,染石棉尘的肺组织中这三种mRNA显著地高于正常对照组。在染尘后60天时Ⅰ型胶原的两种mRNA仍呈上升趋势,而Ⅲ型胶原的mRNA则呈稳定状态。体外实验的结果表明溫石棉及青石棉纤维都可以刺激2BS细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达。矽肺组织来源的致纤维化因子与石棉纤维都具有促进胶原基因表达的作用,其共同作用效果更強。证明这两种因素都参与调节石棉肺的纤维化作用。     

五味子乙素对大鼠肝星状细胞增殖和胶原基因表达合成的影响

目的观察五味子乙素在大鼠肝星状细胞（HSCs）增殖,胶原表达合成方面的作用。方法经在体灌流消化大鼠肝脏分离HSCs,培养于DMEM培养基中,用^3H-TdR和^3H-pro掺入试验测定五味子乙素对HSCs的增殖和胶原合成影响,并用原位杂交方法探讨了其对HSCⅠ、Ⅲ型前胶原基因的表达作用。结果对于培养活化的HSCs,五味子乙素对HSCs摄取^3H-TdR没有明显影响,但在40μmol/L时,剂量依赖地抑制HSCs摄取^3H-proline,并在80μmol/L降低Ⅰ型前胶原基因表达（P〈0.05）。结论五味子乙素具有降低HSCs胶原基因表达合成作用。     

人Ⅳ型胶原的提纯及其抗血清制备

采用胃蛋白酶限制性消化,NaCl分级盐析,还原和烷基化反应,纤维素离子交换层析从人胎盘组织分离纯化Ⅳ型胶原.经SDS-PAGE电泳鉴定符合Ⅳ型胶原α肽链电泳带.用纯化的Ⅳ型胶原免疫兔制备出高效价的特异抗血清.     

人肝纤维化中肌纤维母细胞的组织原位研究

本文以α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）作为肌纤维母细胞（ＭＦｂ）的标志,对７３例人肝组织作免疫组化研究,观察α－ＳＭＡ阳性细胞与Ⅰ、Ⅲ型胶原以及炎症细胞的关系。发现在各种慢性肝病的肝组织中α－ＳＭＡ、Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性率均明显高于对照组;尤其在慢性活动性病变时,α－ＳＭＡ阳性细胞数与Ⅲ型胶原量均多,而在慢性非活动性病例中Ⅰ型胶原量较多;且各组显示α－ＳＭＡ阳性细胞量的曲线与Ⅲ型胶原基本一致。α－ＳＭＡ阳性细胞的增生及分布与炎症细胞的浸润也密切相关。因此,可籍ＭＦｂ（α－ＳＭＡ阳性）的定位检测来判断人肝纤维化的进展情况。     

胚胎骨Ⅰ型胶原的提取与鉴定

应用酸性、中性交互提取法从人胚骨中提取Ⅰ型胶原,经SDS-PAGE电泳,氨基酸分析和免疫学方法鉴定．结果表明所提胶原电泳区带与Ⅰ型标准品相同,环状沉淀反应阳性,氨基酸分析甘氨酸占1000个氨基酸总残基的1/3,羟脯氨酸与脯氨酸之比为0.65,符合Ⅰ型胶原特征,并显示有较高的纯度,可用于胶原制品的制作．     

法乐氏四联症右室流出道心肌间质胶原表达改变

摘要：探讨法乐氏四联症患者右室流出道I、Ⅲ型胶原蛋白mRNA与蛋白质合成的表达改变,以期进一步阐明法乐氏四联症的发病机制．用RT—PCR方法检测32例法乐氏四联症患者与同期17例小室缺患者右室流出道Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达差异,并分析了不同氧饱和度对法乐氏四联症胶原蛋白mRNA表达的影响．同时应用免疫组化图像分析及Western blot检测右室流出道Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量并作对比分析．研究发现法乐氏四联症患者右室流出道Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA与蛋白质合成均较对照组增高并且出现胶原比值改变,缺氧程度与胶原合成关系密切．