动物外泌体分离方法的研究进展*

外泌体是一种由细胞分泌的细胞外囊泡,其广泛存在于各类生物液中,是细胞间信息交流的途径之一。由于外泌体内携带的核酸、蛋白质及脂质等功能性物质可作为生物标记用于动物生理诊断,也可作为信息传输载体用于调节动物生理状态以及治疗动物疾病,因而受到广泛的研究,开发潜力巨大。建立成熟稳定且方便快捷的外泌体分离手段是保证外泌体相关研究顺利开展的前提。以下对当前动物外泌体分离的主要方法进行了综述,比较了不同分离手段的特点,以此为相关技术的进一步开发与后续的动物外泌体研究提供方法及理论参考。     

动物外泌体分离方法的研究进展*

外泌体是一种由细胞分泌的细胞外囊泡,其广泛存在于各类生物液中,是细胞间信息交流的途径之一。由于外泌体内携带的核酸、蛋白质及脂质等功能性物质可作为生物标记用于动物生理诊断,也可作为信息传输载体用于调节动物生理状态以及治疗动物疾病,因而受到广泛的研究,开发潜力巨大。建立成熟稳定且方便快捷的外泌体分离手段是保证外泌体相关研究顺利开展的前提。以下对当前动物外泌体分离的主要方法进行了综述,比较了不同分离手段的特点,以此为相关技术的进一步开发与后续的动物外泌体研究提供方法及理论参考。     

表面增强拉曼散射技术无标记检测乳腺癌细胞来源外泌体

外泌体含有释放细胞的特异性物质,反映了释放细胞的组成成分,成为液体活检的重要物质。为了鉴别正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞来源的外泌体,本研究采用表面增强拉曼(SERS)技术检测乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A来源的外泌体,并且对比两种细胞外泌体的SERS光谱,筛选出相应的特征拉曼光谱。结果发现在800~1800 cm-1区域内,相对MCF-10A细胞,MCF-7来源的外泌体中归属于核酸的拉曼峰相对强度明显增高,且部分脂类峰强有所降低或部分特征峰消失,同时发现MCF-7还表现出其自己独特的拉曼谱型。此结果表明SERS技术可高灵敏度检测不同细胞来源的外泌体细微分子变化,可区分肿瘤细胞来源的外泌体与正常细胞来源的外泌体。SERS技术可作为癌症的早期检测和诊断的一种快速、无标记和无损的方法。     

外泌体组成特征及其作为细胞通讯和分子标记的生物学作用

外泌体是由细胞分泌的直径在30～100 nm之间的微小囊泡状结构,内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子。外泌体可由几乎所有类型的细胞分泌,并且在组织细胞生理和病理情况下皆可持续分泌,存在于多种体液当中。目前,外泌体作为细胞间通讯的新途径和作为疾病诊断的生物标记方面取得瞩目的研究进展。本文从外泌体的组成特征及其生物学作用进行了综述,重点介绍了外泌体作为细胞通讯的新途径和内含的蛋白质和核苷酸作为一种新型的生物标记物在疾病诊断和临床方面的应用潜力,还对外泌体在生命科学研究领域的潜在作用及其存在的问题进行了展望。     

外泌体分离与鉴定方法的研究进展

外泌体是一种由细胞分泌的膜性囊泡小体,存在于多种体液、分泌物和排泄物中,形成一种特殊的细胞间信息传递系统或病理表征,其携带的m RNA、mi RNA和蛋白质等生物分子可作为疾病诊断的新型标志物。建立稳定而成熟的外泌体分离与鉴定方法是进行外泌体及其生物医学意义研究的前提。目前的外泌体分离技术包括离心、沉淀、超滤、免疫亲和及微流控等技术。鉴定技术主要基于电子显微形态学、颗粒大小及浓度的纳米示踪、蛋白质免疫印迹、流式细胞术等。现对这些技术进展进行综述,这将有助于研究者结合自身条件选择合适的方法获取外泌体,以开展相关研究。     

基于微流控技术的外泌体分离方法的研究进展

外泌体是一种由细胞分泌的,直径一般为30-150 nm的囊泡。外泌体携带有多种蛋白质、mRNA及miRNA等生物标记物,并直接参与细胞间的信息传递、抗原传递、蛋白转运以及RNA转录等重要的生命活动过程,与癌症等多种疾病的发生密切相关,因此在疾病的发生机制探索和相关疾病的检测中具有重大的应用价值。然而,外泌体通常以游离的形式存在于体液中,对外泌体的分离和纯化是实现基于外泌体的疾病发生机制及疾病检测应用研究的基础。近年来,研究人员利用外泌体的生物物理和生物化学性质研发了多种分离和纯化外泌体的方法技术,主要有超速离心法、聚合物沉淀法、免疫分离法以及基于微流控的分离法等。综述了近年来外泌体分离和纯化方法的研究进展,简要论述了传统的外泌体分离方法,重点介绍了基于微流控技术的外泌体分离方法,并比较了这些方法的分离机制、优缺点以及应用前景。通过对近年来外泌体分离和纯化方法的研究现状进行归纳和比较,旨为相关研究人员开展外泌体研究工作提供参考,从而进一步推进外泌体在疾病检测及其他生物医学应用的研究进展。     

外泌体糖基化在疾病诊断及治疗中的应用

外泌体由脂质双分子层构成,内含多种生物分子,如蛋白质、核酸、糖类等,具有调节生命活动的作用,其蛋白质组分也可反映分泌细胞状态。糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式,糖基化蛋白对于维持细胞稳态、细胞间互作等生理功能具有重要作用。近年来,有关于外泌体的研究大多关注外泌体核酸成分如miRNA、mRNA、lncRNA等的功能。外泌体膜蛋白也含有丰富的糖链,且具有重要的病理生理意义。本文着重介绍外泌体糖基化的结构、研究方法、在肿瘤等疾病中的分子功能以及在疾病诊断、治疗中的临床应用和前景。外泌体糖基化研究将随着技术的革新不断深入,有望成为多种疾病临床诊疗的重要手段。     

脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定

目的探讨脐带间充质干细胞的外泌体的获取与鉴定方法。方法通过组织块贴壁法从胎儿脐带分离和培养脐带间充质干细胞并通过RiboTMExosome Isolation Kit收集外泌体,采用电镜和流式细胞仪鉴定外泌体。结果第二代脐带间充质干细胞表面CD45、CD34和HLA-DR呈阴性表达,CD29、CD44和CD105呈阳性表达;在透射电镜下观察到脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构,内含低密度物质;流式细胞检测外泌体CD9、CD63、CD81和CD83呈阳性表达。结论在培养脐带间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过电镜和流式细胞仪对脐带间充质干细胞的外泌体进行鉴定。     

外泌体作为疾病诊断标志物及药物载体的应用前景

作为一种纳米级别的囊泡,外泌体的相关研究近年来逐渐成为热点。外泌体来源于细胞内的多囊泡胞内体,经由细胞膜释放到细胞外。由于来自特定细胞类型的外泌体含有多种特异性的蛋白质和microRNA,使其成为了可以广泛用于疾病诊断及预后的新型生物标志物。相较于其他外源性药物载体,外泌体具有更低的免疫原性,并能够靶向作用于病变细胞。这使得由细胞天然产生或经过人工改造的外泌体作为一种新兴的药物载体具有良好的发展前景。特别是近几年,外泌体在临床应用领域的发展潜力不断获得拓展,针对肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病、神经退行性病变等重大疾病,以外泌体为基础的疾病诊断和药物的研发都取得了快速的进步。本篇综述重点介绍了外泌体作为一种生物标志物在疾病诊断和预后中的应用,同时阐述了外泌体作为一种新兴的药物载体所具有的优势以及存在的问题。     

外泌体在肝纤维化中的作用

外泌体(exosomes)是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡,是具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡。现认为外泌体是细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)的一种亚群。研究表明,外泌体是细胞间信息传递的一种载体。肝脏既可以分泌外泌体,同时也是其他组织细胞产生的外泌体的作用靶点,且肝内与肝外来源的外泌体与肝纤维化的形成、发生、发展均有密切联系。本文主要就外泌体在肝纤维化相关疾病中的作用及外泌体与肝纤维化指标之间的关系进行综述。     

一种大容量细胞灌流液中外泌体的提取方法及鉴定*

目的: 建立一种从大容量细胞灌流液中提取外泌体的方法,并进行外泌体的鉴定。方法: 人脐静脉内皮细胞株(EA.HY926)是人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌细胞株A549杂交成的永生化细胞株,因其具有血管内皮细胞的特性,广泛用于内皮细胞相关研究。本研究采用含10%胎牛血清的M199培养基培养,利用Flexcell STR-4000平行板流室系统对EA.HY926施以振荡剪切应力。收集流体剪切应力处理后的细胞灌流液,去除细胞碎片后冻成干粉,脱盐、提取纯化外泌体。电镜观察外泌体形态、纳米粒径电位分析仪检测外泌体大小、PKH26染色检测外泌体膜性结构、BCA蛋白定量法检测外泌体的蛋白浓度、Western blot检测外泌体特异性蛋白CD9和CD81的表达,荧光定量RT-PCR检测内皮细胞相关基因的表达。结果: 该方法提取的外泌体,大小均一,结构完整,呈典型囊泡样结构;粒径集中在30~150 nm,多数粒径为97.63 nm;表达外泌体特异性蛋白CD9和CD81;PKH26染色阳性,并可被细胞摄取;EA.HY926分泌的外泌体表达内皮细胞相关的CD31、vWF等mRNA,以及miR-126、miR-21、miR-155等microRNA分子。结论: 本方法能够有效从大容量细胞灌流液中提取到结构完整的、高浓度、高质量的外泌体,为开展以流体力学干预细胞为基础的外泌体相关研究提供技术方法。     

凝胶电泳微流控芯片提取外泌体及对人血浆外泌体中miRNA-21的测定

为了开发一种用于人体血浆中外泌体的高效快速提取和分离的新型微流控芯片,文中收集健康人体外周血液样本,自主设计并制备基于纳米多孔薄膜和琼脂糖凝胶电泳的微流芯片。提取的外泌体使用透射电镜、Nanosight和Western blotting等技术进行表征,鉴定并分析其形态、浓度和粒径分布。同时将超速离心法和微流芯片所提取的外泌体进行粒径和浓度的分析比较,探讨两种方法各自的提取效率。最后,利用RT-PCR技术分析外泌体中miRNA-21的相对表达量。凝胶电泳微流芯片可在1 h内快速的从血浆中高效率地提取出纯度高、大小完整、尺寸分布在30–200 nm之间的外泌体,满足后续下游分析的要求。通过与现有最普遍的超速离心法进行对比分析,当血浆样本量小于100μL时,凝胶电泳微流芯片提取外泌体的效率为超速离心法的3.80倍。凝胶电泳微流芯片提取外泌体的优化参数是:电场电压:100 V;琼脂糖凝胶浓度:1.0%;注射泵流速:0.1 mL/h。凝胶电泳微流芯片可快速高效地提取出外泌体,对外泌体与癌症生物标记物的相关研究具有潜在的巨大优势,也为基于外泌体的即时诊断技术提供了可能。     

多发性骨髓瘤患者血清外泌体提取方法优化与应用

外泌体提取方法多样,目前没有统一的标准,每种方法都各有其优缺点,因此该文针对多发性骨髓瘤患者血清中外泌体的两种提取方法进行比较,总结出一种适合患者血清这种量少而珍贵标本的外泌体的提取方法。试剂盒提取方法能够获得充足的外泌体但是会引入杂质。差速超离方法获得的外泌体量较少,损耗过多的外泌体,难以进行后续外泌体内RNA提取等实验,因此获取外泌体内的蛋白或核酸存在困难。该研究将差速超离提取方法以及试剂盒提取方法两者的优点结合,总结出一种更省时、便捷,获得更高纯度外泌体的方法。     

近红外荧光蛋白标记乳腺癌细胞外泌体的构建及鉴定

外泌体(Exosomes)是一种大小为30~100 nm的细胞外膜囊泡,与细胞的生物学功能及细胞间的信号传递有着密切的关系,尤其在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。为将外泌体更好地应用于乳腺癌肿瘤传递机制的研究,本文首先通过分子克隆手段将近红外荧光蛋白iRFP682基因和外泌体标记蛋白CD63基因克隆到含腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)末端倒置重复序列(Inverted repeat terminal,ITR)的质粒载体上,构建融合表达近红外荧光蛋白和CD63蛋白的重组真核表达载体。然后再与辅助质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒、纯化测量滴度后用于感染乳腺癌细胞,最后通过荧光筛选出稳定表达近红外荧光蛋白的乳腺癌细胞株。通过对乳腺癌稳定株的分离、纯化及鉴定,最终得到一个新型生物标记物：iRFP682标记的乳腺癌细胞来源的外泌体,为后续研究外泌体在乳腺癌肿瘤微环境中的分布及信号传递提供保障。     

人脐血血浆外泌体提取方法的比较北大核心CSCD

为探寻高效且稳定的提取人脐血血浆外泌体的方法,利用超高速离心法、蔗糖垫密度梯度离心法、改良超速离心法和聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)沉淀法提取人脐血血浆外泌体,并比较4种方法的优劣。利用透射电镜、动态光散射技术观察外泌体的形态、结构及大小;聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid, BCA)法测定外泌体蛋白总量;Western blotting检测外泌体表面标志蛋白CD63、HSP70以及外泌体阴性蛋白GM130 (高尔基标志蛋白)的表达。结果表明,与提取外泌体的“金标准”,即超高速离心法相比,蔗糖垫密度梯度离心法稳定性好,获取的外泌体粒径较均一,但操作较复杂,耗时长;改良超速离心法操作较简单,纯度较高;PEG沉淀法提取的外泌体蛋白量最高,操作时间最短,但杂质较多。结果表明,4种方法均能从人脐血血浆中获取外泌体,但在操作时间、纯度、提取量等方面存在一定差异。因此,应根据实验目的和具体要求选择合适的提取人脐血血浆外泌体的方法。     

外泌体在免疫调控及肿瘤发生中的功能

已知细胞间的信息交流不仅可以通过直接接触,或释放信号分子等方式,同时还存在另一种细胞通讯方式即释放外泌体。外泌体是由细胞分泌,直径为30～100 nm的囊泡结构。外泌体含有蛋白质、脂质、mRNAs和miRNAs等成分,并且能够靶向运输到其他细胞或组织中,从而在细胞间的信息交流、物质传递方面发挥重要作用。本文对外泌体的基本特征、形成过程、功能以及在疾病诊断与治疗中的应用等方面进行简要综述,重点介绍外泌体在免疫调控和肿瘤发生方面的功能。外泌体作为一种广泛存在的亚细胞成分,虽然体积小,组成成分简单,然而,其复杂功能具有重要的研究价值。对外泌体功能的深入了解将为肿瘤等疾病的预防和治疗提供更多的诊断标志物、疫苗以及治疗思路与手段。     

外泌体提取及保存技术研究进展

外泌体是多种活细胞经过"内吞–融合–外排"等一系列过程主动向胞外分泌的纳米级双层膜结构小囊泡,广泛存在于血液和尿液等生物体液中。因其携带着多种蛋白质、核酸和脂质等生物活性分子,所以外泌体不仅在细胞间物质交换和信息传递中发挥重要作用,而且对疾病诊断、预后预测和治疗管理等均具有提示意义。外泌体的高效提取、分离和完整保存是研究其在机体内生物学作用和功能的重要前提,也是制约基于外泌体的临床检测技术和治疗载体技术的关键。该综述将针对目前国内外外泌体提取和保存领域的最新研究进展加以综述,并对其特点进行对比和分析,以促进外泌体研究方法的标准化,以及相关技术的研发和应用拓展。     

血管内皮细胞外泌体的生物学作用及其分子机制的研究进展

外泌体是细胞分泌的一种纳米级胞外囊泡,通过携带蛋白质和核酸等小分子物质参与细胞间信号交流。内皮细胞来源的外泌体在许多病理生理过程中起着十分重要的作用。现综述血管内皮细胞外泌体的生物学作用及其分子机制的最新研究进展,重点关注血管内皮细胞外泌体在心血管疾病、缺血再灌注损伤、肿瘤发生发展和免疫调节等过程中的重要作用,及其调控受体细胞功能的分子机制。     

肿瘤细胞来源的外泌体与恶性肿瘤的进展及化疗

外泌体是细胞分泌的一种纳米级囊泡结构,在血液、唾液、尿液等多种体液中均有分布.作为一类重要的细胞间通信分子,外泌体含有多种具有生物活性的成分,可通过多种方式在人体中发挥调节作用.目前在多种类型的细胞中均发现外泌体的存在,而肿瘤细胞来源的外泌体由于其本身的特性和功能特点,可通过微环境介导肿瘤细胞的增生、血管形成和免疫耐受,并可通过介导上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）
和胞内药物排斥反应等增加肿瘤细胞的化疗抵抗能力.同时,因其含有肿瘤细胞所分泌的特异性成分,因而可通过对外泌体中相关分子改变的检测,对疾病进行诊断和监测,并可为临床个体化用药提供新思路.     

外泌体靶向递药在肿瘤治疗中的进展

外泌体是由细胞分泌、粒径为30～ 150 nm的纳米囊泡.外泌体具有优越的生物相容性、良好的载药功能以及便于修饰的膜表面,是一种具有潜力的药物递送载体.在肿瘤治疗研究中,可利用具有靶向识别功能的外泌体来降低脱靶效应,减少不良反应,达到增强治疗效果的目的 .归纳了用不同修饰方法增强外泌体靶向性的研究进展,总结了近五年来利...