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本研究通过缺失突变和移码突变研究了ctx B基因上游A基因部分序列对ctxB表达水平的影响,结果表明:(1)将霍乱毒素操纵子XbaI-EcoRi片段克隆至pUC19,构建的质粒pUC19CTB中A亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠菌后的CTB的表达产量为30μg/μl;(2)在质粒pUC19CTB的XbaI位点引入移码突变,构建质粒pMC02C,使A亚基基因部分序列能够翻译至自然的终止密码,B 相似文献
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肠毒素性大肠杆菌CS6菌毛抗原与霍乱毒素B亚基在痢疾菌中的表达及其免疫学效果 总被引:5,自引:0,他引:5
构建了携带asd、霍乱毒素B亚基(CTB)基因的表达质粒pYX201,与福氏2a痢疾菌T32的△asd突变株FaD构成宿主质粒平衡致死系统,用于在没有抗生素选择压力的情况下,稳定表达CTB抗原基因。以此为基础,构建了单独表达肠毒素性大肠杆菌CS26菌毛抗原基因的重组质粒pYX202,以及同时表达CS6和CTB的共表达质粒pYX203。Western blotting和ELISA检测结果证实CS6及CTB在痢疾菌FaD中可以有效表达。重组菌免疫家兔后可诱生相应的血清抗体,特别是CTB的抗体效价较高,并持续较长时间。本研究为细菌性腹泻疫苗的研究提供了候选株。 相似文献
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本研究通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了HBV PreS_2抗原决定簇基因,与ctxB基因的3’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达30μg/ml,表达产物95%以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂GM1结合,说明融合蛋白保持了CTB的基本高级结构和生物学功能;ELISA实验证明融合蛋白具有CTB和HBV PreS_2的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白的免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。 相似文献
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霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子 总被引:5,自引:0,他引:5
本研究发现并证实霍乱毒素B亚基基因上游XbaI~ClaI限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素B亚基表达水平可达200mg/L,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在0.3~10mg/L之间,大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的表达量达4100单位/ml。在该启动子的控制下霍乱毒素B亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是霍乱毒素操纵子中霍乱毒素B亚基表达量是A亚基的6倍的原因。 相似文献
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霍乱毒素B亚基(CTB)是良好的免疫佐剂和载体蛋白。本研究通过定点突变,在CTB基因(ctxB)3′端终止密码前引入了限制性内切酶EcoRI,构建了质粒pMC05。pMC05中CTB与下游lacZ′基因阅读框架相同,转化大肠杆菌后能够表达CTB与β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白;所表达的融合蛋白能与GM1结合,说明融合蛋白保持CTB的基本高级结构和生物学活性;融合蛋白能与抗-CTB抗体结合,说明融合蛋白具有CTB的抗原性。以上结果表明:通过将外源抗原决定簇基因融合至ctxB的3′端,在大肠杆菌中表达融合蛋白,构建基因工程肽苗是可行的。还探索了转录终止序列对融合基因蛋白表达水平的影响,构建了高效表达融合蛋白的载体-宿主系统。 相似文献
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λN基因前导序列对下游基因表达的控制作用 总被引:2,自引:0,他引:2
已有研究表明,λN基因上游的TIR(Translational initiation region)的改变可提高λN基因的表达,而且表达量的差异是在翻译水平,构建了3类λN基因上游TIR的突变体质粒,并通过测定它们在大肠杆菌转化体中表达的β-半乳糖苷酶的活性和进行RNA-DNA圆点印迹杂交实验证明,由于λN基因上游有一个翻译效率很低的编码19个氨基酸的短肽的可读框(ORFλN),因而使λN基因的表达也较低,如果使ORFλN提前终止或改变ORFλN,的TIR序列可提高翻译效率,能在翻译水平上有效地提高下游λN基因的表达。 相似文献
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含大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)基因(argS)的pUC18重组质粒,在大肠杆菌TG1转化子中能够高表达ArgRS近1000倍。为了研究大肠杆菌argS的表达调控,构建了一系列的缺失突变。分别缺失全部上游序列(argS△1)、Shine-Dalgarno(SD)区(argS△2)和缺失启动子-10区下游(相当于翻译起始位点-65nt,argS△3)前的上游序列后的变种argS都不能表达ArgRS。而缺失-122nt(距翻译起始位点-180nt,argS△8)、-70nt(距翻译起始位点-128nt,argS△7)、-52nt(距翻译起始位点-110nt,argS△6)、-35区9距翻译起始位点-94nt,argS△5)、启动子-10区(距翻译起始位点-71nt,argS△4)前的上游序列后,这些缺失突变基因的表达水平与野生型argS接近。但argS△4、argS△5、argS△6都会形成部分包涵体。通过RNA斑点杂交测定发现,argS△4、argS△5和argS△6的mRNA转录量为argS及argS△7的2到3倍。即-52nt和-70nt之间的19个碱基(AATAGTGAAAACGGCAATA)可能是大肠杆菌argS舞场康负调控区。该元件的缺失将使得ArgRS过快表达并导致部分蛋白质形成包涵体。凝胶阻滞分析也发现在细胞粗抽液中有一个因子可以专一地与这个负调控元件结合,它可能参与该基因的表达调控。精氨酸专一性地诱导argS的转录,其作用与上述转录负调控区相关。 相似文献