天蚕卵黄原蛋白cDNA的克隆及序列分析

天蚕卵黄原蛋白cDNA的全碱基序列由5 720个碱基构成,一个开读框有5 334个碱基序列,编码了包括由15个氨基酸组成的信号肽在内的共1 778个氨基酸的蛋白质前体。天蚕和柞蚕卵黄原蛋白的同源性非常高,氨基酸序列达到92.6%,碱基序列达到94%。天蚕、柞蚕和家蚕的卵黄原蛋白的糖链附加位点(N-linkedg-lycosylationsite):柞蚕有4个,家蚕有5个,天蚕和家蚕相同保存着5个。在N-末端区域,天蚕和家蚕有多聚丝氨酸区域和可被胰蛋白酶识别的RSRR部位;柞蚕虽然也具有多聚丝氨酸区域,但没有可被胰蛋白酶识别的RSRR部位。在C-末端区域里,大多数昆虫从G ICG功能部位至C-末端结尾具有7个~10个半胱氨酸(Cys)。鳞翅目的4种昆虫柞蚕、天蚕、家蚕和舞毒蛾(A.pernyi,A.yam am ai,B.m ori,L.dispar)都是7个半胱氨酸。     

野桑蚕卵黄原蛋白的鉴定及cDNA序列分析

利用SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定了野桑蚕Bombyx mandarina Moore卵黄原蛋白,发现该蛋白由大小两个亚基组成,分子量分别为175 kD和42 kD。利用昆虫卵黄原蛋白进化上的保守性,根据家蚕的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物在野桑蚕的总RNA进行RT-PCR扩增,对于3′和5′端进行RACE扩增,解析获得了野桑蚕卵黄原蛋白cDNA全序列(GenBank登录号AY 309967)。该序列含有5.754个碱基,由一个开放阅读框组成,编码1.780个氨基酸,卵黄原蛋白的氨基酸序列与家蚕的同源性达到97.6%。在特定的酶切位点(RSRR)处,即第364～367个氨基酸位置,卵黄原蛋白前体被酶切为大小两个亚基,根据氨基酸推算的相对分子质量分别为161.571 kD和40.794 kD,如果考虑到翻译后的修饰,这与SDS-PAGE的结果是吻合的。同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白一级结构分化基本上局限在同一目内,具有较高的保守性。     

柳蚕卵黄原蛋白cDNA的克隆及序列分析

经RT-PCR和RACE合成了柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA,经序列分析其长度为5701个碱基,由一个ORF组成,编码了1 774个氨基酸。氨基酸序列中有2个保守的多聚丝氨酸区域。并推测氨基酸序列中有8个天冬酰胺连接的糖基化位点(N-linked glycosylation sites)。与樟蚕、天蚕、柞蚕、野桑蚕、家蚕、樗蚕、蓖麻蚕的VgcDNA序列比对后发现有很高的同源性,分别为83.1%、81.1%、81.0%、64.7%、64.6%、79.7%、79.2%,同其它昆虫Vg cDNA序列也具有很高的同源性。根据7种蚕(家蚕、天蚕、柞蚕、蓖麻蚕、樟蚕、野桑蚕、樗蚕)VgcDNA序列建立了系统发生树。     

红光熊蜂卵黄原蛋白基因的cDNA全长序列克隆和表达分析

红光熊蜂Bombus ignitus Smith是许多经济作物和野生植物的重要授粉昆虫之一。卵黄原蛋白基因(vitellogenin,Vg)在昆虫的生殖调控中和行为方面起到重要的作用,本试验对Vg基因全长cDNA的克隆和测序及在蜂王、工蜂和雄性蜂三型蜂中的表达分析得出:Vg基因的全长cDNA为5 481 bp,GenBank中的登录号为FJ913883,有一个完整的开放阅读框(ORF),编码1 772个氨基酸,N-末端的前16个氨基酸为一个信号肽。接近C-末端区域存在保守的GL/ICG基元,其后含有9个半胱氨酸,而且DGXR位于GL/ICG基元上游18个氨基酸残基处。其氨基酸序列与韩国的熊蜂B.ignitus和B.hypocrita相似性高达95%,与西方蜜蜂Apis mellifera的相似性达到51%。Vg的mRNA首先在蜂王蛹期的白眼蛹(Pw)时期出现,其表达量在蜂王整个蛹期发育过程中呈上升趋势,且在黑眼蛹(Pbd)时期达到最高,在成年蜂的脂肪体中的表达量仍在升高,甚至更高。Vg也在工蜂蛹期的白眼蛹(Pw)时期被检测到,然后在整个蛹期发育过程中呈现上升趋势,在刚羽化出房时达到高峰,Vg的mRNA水平随着成年蜂日龄的增加而增加,到15日龄时达到最高,然后呈现下降趋势。对于雄性蜂,Vg的mRNA虽然卵黄原蛋白基因的mRNA水平几乎在整个蛹期发育阶段都表达,但是表达水平非常低,只有在刚羽化出房时期表达水平较高。     

黑尾叶蝉卵黄原蛋白受体基因cDNA的克隆、序列分析及表达模式

【目的】卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)属于低密度脂蛋白受体,通过介导内吞作用为发育中的卵母细胞摄取卵黄原蛋白,为胚胎发育提供营养物质,在昆虫生殖过程中发挥关键作用。为研究黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps VgR(NcVgR)基因的生理功能及其在生殖中的作用,本研究克隆并解析了NcVgR基因的序列,并对其时空表达进行了研究。【方法】根据黑尾叶蝉转录组数据信息,利用RT-PCR克隆了NcVgR基因,并进行了生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR研究了不同发育时期、成虫不同组织NcVgR的表达水平。【结果】NcVgR c DNA序列全长6 676 bp,开放阅读框长度5 568 bp,编码1 855个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为206 k D,N端前17个氨基酸为信号肽。序列分析显示,NcVgR具有低密度脂蛋白家族的5个经典保守域,即:配体结合域(ligand-binding domain,LBD)、表皮生长因子前体同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)、O-糖链结构域(O-linked sugar domain,OLSD)、跨膜域(transmembrane domain,TMD)和胞质尾域(cytoplasmic domain)。系统发育分析表明,NcVgR与褐飞虱N.lugens VgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,NcVgR转录起始时间为5龄若虫,羽化后转录水平逐渐上升,至羽化后8 d达到峰值,随后下降。有意思的是,随着黑尾叶蝉产卵,NcVgR转录水平再次上升,至羽化后16 d达到最高水平。组织定位结果显示,NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性高表达,而在雌成虫脂肪体和肠道中微量表达,在雌成虫脑及雄成虫中均未检测到表达。【结论】NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性表达,并且不同发育时期具有不同的表达量,这为研究黑尾叶蝉的生殖调控机理提供了分子信息。     

家蚕卵黄原蛋白及其受体基因

家蚕小卵突变体 (Smalleggmutant ,sm) ,其卵体积仅及正常卵的 2 / 3,不能受精而致死。因其卵母细胞不能正常吸收卵黄原蛋白 (Vg) ,人们认为其原因可能是卵黄原蛋白受体基因 (VgR)突变所致。本研究首先通过克隆筛选和基因组序列分析 ,获得了 2 5 6 4bp含有 ployA的家蚕卵黄原蛋白受体基因 (BmVgR)片段。将该基因片段的预测蛋白与其它物种的VgR/YPR和低密度脂蛋白受体 (LDLR)家族比较 ,发现该基因具有LDLR家族的基本结构特征。其次 ,经RT PCR检测 ,结果表明BmVgR在sm的不同时期的卵母细胞中都能正常转录。最后 ,分别对sm不同发育时期的体液和卵的总蛋白进行SDS PAGE分析 ,发现该突变体的卵母细胞不能正常摄取体液蛋白 (包括Vg)。综合分析 ,sm不能正常摄取Vg ,可能并不是VgR的功能异常导致 ,而是与滤泡细胞异常有关     

蜜蜂卵黄原蛋白的作用

卵黄蛋白不仅为胚胎发生提供营养物质,它在生物体内还具有其他的生物学功能。昆虫卵黄蛋白是昆虫卵内的营养储备,它的前体主要来源于脂肪体的雌性特异血蛋白——卵黄原蛋白(Vg),它是近年来昆虫生理学和生化学最活跃的领域之一,文章介绍蜜蜂卵黄原蛋白在蜜蜂生殖过程中的作用,以及与蜜蜂社会性生活及寿命的关系。     

蓖麻蚕卵黄磷蛋白鉴定、纯化及抗血清制备

本文通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)法,分析了蓖麻蚕卵黄蛋白质组分,对即黄磷蛋白(Vitellin Vn.)进行了鉴定、纯化,并制备了抗血清。对卵黄磷蛋白的分子量及相对含量进行了测定。并证明卵黄磷蛋白若处在酸性pH条件下能降解。     

烟粉虱MEAM1隐种卵黄原蛋白受体基因cDNA的克隆、 序列分析及在不同发育时期的表达

卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR）是卵黄原蛋白被卵母细胞摄取的关键因子, 在卵黄发生和卵母细胞发育等生理过程中发挥着重要作用。为探讨烟粉虱Bemisia tabaci VgR的功能, 我们采用RT-PCR和RACE等技术扩增了烟粉虱MEAM1隐种B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MAEM1) 的VgR基因cDNA 全长序列。生物信息学分析表明, 烟粉虱MEAM1隐种的VgR基因cDNA全长5 774 bp, 编码1 919个氨基酸, 推测分子量约201 kDa, N-端前31个氨基酸为信号肽。烟粉虱MEAM1隐种的VgR属于低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDLR）家族, 蛋白质三维结构预测分析表明, 该受体具有LDLR家族基因典型的保守功能结构域。通过实时荧光定量PCR技术研究了烟粉虱MEAM1隐种VgR基因不同发育时期的表达, 结果表明VgR基因在伪蛹期开始表达, 并在羽化后1 d达到高峰, 此后逐渐降低, 3 d后又逐渐升高, 直至羽化后7 d达到峰值。研究结果丰富了卵黄原蛋白受体家族基因的数据库, 为今后深入研究并揭示烟粉虱卵黄发生的调控机制奠定了基础。     

两株蓖麻蚕核型多角体病毒的比较研究

本文描述来源不同的两株菌麻蚕多角体病毒的形态特征和理化特性。一株为较长期饲喂马桑叶的蓖麻蚕从自然罹死的幼虫和蛹中分离的多角体病毒（简称ArscsNPV);另一株为饲喂蓖麻叶的蓖麻蚕从幼虫分离的核型多角体病毒（简称ArscsNPV);另一株为饲喂蓖麻叶的蓖麻蚕从幼虫分离的核型多角体病毒（简称ArNPV)。两株核型多角体病ArNPV多角体大小约1．2－2．0μm最大的可达2．9μm。两株NPV病毒粒子均为杆状,ArscsNPV病毒粒子大小平均为310×50nm;ArNPV病毒粒子大小为350×50nm。两株NPV均为多粒包埋型。两株NPV的多角体蛋白均为单一组分,ArscsNPV多角体蛋白分子量为27．5kd;ArNPV多角体蛋白分子量为28kd。两株NPV的病毒粒子结构多肽均含有21条多肽,其中各多肽分子量有所差异。ArscsNPV的病毒粒子多肽分子量范围为11－130kd;ArNPV病毒粒子多肽分子量范围为11－96kd,其中有11种多肽了量彼此相同包括两种主要多肽（54kd和33kd）。用SDS－苯酚提取的病毒核酸,经实验证明均为双链DNA型使用几种内切酶酶解,求得两株NPV的核酸分子量,ArscsNPV为52．4×10^6d;ArNPV为73．5×10^6d。     

Analysis of oral infection and helicase gene of the nucleopolyhedroviruses isolated from Philosamia cynthia ricini and Antheraea pernyi

Philosamia cynthia ricini is an important commercial silkworm in Asia. In this report, a nucleopolyhedrovirus isolated from P. cynthia ricini (PhcyNPV) larva was purified and compared with Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus (AnpeNPV), a pathogen of A. pernyi, another commercial silkworm in China. The two viruses had similar polyhedral morphology and shared high sequence homologue of viral fragments including the p143 gene. However, the restriction fragments, digested with SalI, XhoI, HindIII and PstI, respectively, were different. The cross-infectivity of the two viruses was also tested. AnpeNPV caused 57% mortality in larvae of P. cynthia rici, whereas PcrNPV did not kill larvae of A. pernyi. Results indicated that PhcyNPV and AnpeNPV had closed relatedness, and that PhcyNPV might be a variant of AnpeNPV.     

大豆花叶病毒胁迫诱导的消减文库构建及初步分析

大豆花叶病毒病是危害大豆产量和品质的主要病害之一 ,通过分子手段研究大豆花叶病毒病基因的抗病相关基因表达可以辅助抗病育种工作。利用SSH技术 ,对抗大豆花叶病毒病的大豆品种 814 3进行分析 ,构建大豆花叶病毒胁迫诱导表达的cDNA文库 ,并对文库进行初步分析。     

蚕豆豆类胰岛素基因的cDNA克隆及序列分析

为探明豆科植物中豆类胰岛素基因的结构特征与进化关系,在已获得大豆豆类胰岛素基因的基础上,以蚕豆种子胚根mRNA为材料,采用RT-PCR技术,克隆了蚕豆豆类胰岛素基因的cDNA序列,编码的前体多肽包括信号肽、成熟型豆类胰岛素及另一多肽的45个氨基酸残基。DNA序列分析表明,克隆片段与大豆和豌豆的同源性分别为62.5%和58.7%。在氨基酸水平上分别具有44.2%和43.6%的同源性,其中存在着高度保守的半胱氨酸位点,它们在维持豆类胰岛素的空间结构与生理功能方面,可能具有重要的作用。 Abstract:In order to elucidate the relationship between the structural features of leginsulin gene in legume plants and their phylogenetic significance,we have cloned the cDNA sequence of leginsulin gene from radicles of broad bean (Vicia faba) via RT-PCR techniques according to the leginsulin gene sequence we previously obtained from soybean (Glycine max).The cloned cDNA encoded for a precursor protein consisting of the signal peptide,mature leginsulin and an additional 45 amino acids of another polypeptide.A sequence search for homology comparison revealed the cloned leginsulin cDNA fragment shares 62.5% and 58.7% similarity to soybean and pea,respectively.The results also shown that leginsulin cDNA from broad bean presents 44.2% and 43.6% amino acid sequence homology with soybean and pea (Pisum sativum),respectively,and that there exists highly conserved cysteine sites among the leginsulin cDNAs,which may play a crucial role in maintaining the three-dimensional structure and the physiological functions of leginsulin.     

Characterization of glutathione S‐transferase in the saturniid moth,Samia Cynthia pryeri (Lep.: Saturniidae)

An enzyme, which possesses glutathione S‐transferase (GST) activity, has been found in the midgut of the saturniid moth, Samia cynthia pryeri. The enzyme was initially purified into homogeneity by ammonium sulphate fractionation, affinity chromatography, and ion‐exchange chromatography. The resulting enzyme revealed a single band with a molecular mass of 23 kDa by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide electrophoresis under reduced conditions. When tested with 1‐chloro‐2,4‐dinitrobenzene, a universal substrate of GST, the purified remnants had an optimum pH of 8.0 for enzymatic activity, and was fairly stable at pH 5–9 and at temperatures below 40°C. The enzyme was also responsive to 4‐hydroxynonenal, a cytotoxic lipid‐peroxidation product. The present GST was inhibited by organophosphorus and pyrethroid insecticides including fenitrothion, permethrin and deltamethrin.     

Detection of a single copy gene on a mitotic metaphase chromosome by fluorescence in situ hybridization (FISH) in the sawfly, Athalia rosae (Hymenoptera).

Mitotic metaphase chromosomes of Athalia rosae (Hymenoptera) haploid males were subjected to fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis using an rDNA probe and two vitellogenin (Vg) cDNA probes (one representing the 5' half and the other the 3' half of the gene, each about 3 kb long, and together covering the entire coding region). The rDNA probe produced signals in four chromosomes, all in pericentromeric regions (haploid chromosome number = 8), and the Vg probes, either the combined probes or the 3' region alone, produced a twin signal in the middle of a chromosome arm of a single chromosome. Arch.     

梅花鹿鹿茸尖端组织ESTs分析

文章通过对东北梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)鹿茸尖端组织cDNA文库随机测序获得了906条高质量ESTs,906条ESTs拼接后代表了701个Unigenes,其中包括重叠群86个,单拷贝615个。Blast分析显示具已知和推测功能的基因580个(82.7%),通过Gene Ontology(GO)分类对获得的580个功能基因进行了包括分子功能、生物过程和细胞组分在内的3个层次的功能注释,并根据BLAST的注释结果及进一步的筛选与分析,共得到39条与鹿茸尖端组织生长发育相关的基因。cDNA文库的构建和ESTs分析填补了鹿科动物在NCBI公共数据库上基因组信息的空白,并为科学的开发和利用梅花鹿资源提供了重要的理论依据。     

Vitellogenins and vitellins in the bean bug,Riptortus clavatus (hemiptera: alydidae): Purification,immunological identification,and induction by juvenile hormone

Vitellogenins (Vgs) and vitellins (Vns) were purified from reproductive female adult hemolymph (HL) and newly laid eggs of the bean bug, Riptortus clavatus. They were separated into two (Vg-1 and 2) and three (Vn-1′, Vn-1, and Vn-2) sub-components, respectively, by ion exchange chromatography. Fused rocket immunoelectrophoresis using anti-(Vn-1) serum showed that they are distinguished clearly into two immunologically distinct groups, i.e., Vg-1/Vn-1/Vn-1′ and Vg-2/Vn-2. SDS-PAGE analysis showed Vn-1 (Vn-1′) and Vn-2 have the same and/or smaller subunit component polypeptides as Vg-1 and Vg-2, respectively. Vn-1′ has some lower molecular weight peptides than Vn-1. Quantitative rocket immunoelectrophoretic analysis showed that Vg-1 and Vn-1 (plus V-1′) were detected first on day 3 in the HL and day 4 in the ovary, respectively, after adult emergence, and increased by day 10 in non-diapause female adults. Vg-1 synthesis is induced in diapause female adults in 1 day after the treatment with juvenile hormone (JH) and JH analog (JHA) or in a few days after transfer from short day to long day conditions. © 1996 Wiley-Liss, Inc.     

人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞(HUS-98)cDNA文库的构建及鉴定

为了进一步分离人尿道(阴茎)鳞癌组织特异性表达基因和鳞癌特异性相关基因,采用SMART技术,构建了人尿道 (阴茎)鳞癌上皮细胞cDNA文库,从人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo(dT)引物 合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链 cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果表明原始人尿道(阴茎)鳞癌上 皮cDNA文库获得1.57×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.0×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为2.5kb。 构建的人尿道(阴茎)鳞癌上皮cDNA文库具有良好的质量,该cDNA文库为进一步筛选鳞癌抑癌基因及鳞癌特异性表达基因 奠定了基础。