多核苷酸的合成与研究——Ⅴ.一种由3′端向5′端延伸的脱氧寡核苷酸的化学合成与抽提分离的新方法

化学合成特定顺序的DNA片段,目前除广泛采用三酯方法外,对二酯方法的合成与分离也作了不少的研究。为了用抽提法制备5′端带磷的片段,有些实验室曾采用三苯甲基苯硫乙醇、三苯甲基对胺基苯酚及三苯基苯胺等来保护5′端磷酸基,但这些磷酸上的保护基脱落条件比较复杂,产物回收也不够理想,抽提分离的片段长度一般在二核苷二磷酸。本文则用DMT选择性地保护5′核苷酸的3′羟基,抽提制备了脱氧二核苷二磷酸dpG~(BZ)pA~(BZ)-ODMT和脱氧四核苷四磷酸dpC~(An)pG~(Bz)pG~(BZ)pA~(Bz)-ODMT片段。     

一种用于检测5′-核苷酸磷酸二脂酶的荧光底物合成方法

本文利用间苯二酚为原料合成4-甲基伞形酮,继而经过磷酸酯化,缩合等反应过程合成4-甲基伞形酮-5′-胸腺嘧啶核苷磷酸二酯。反应过程中对胸腺嘧啶核苷的3′位羟基未加任何保护,缩合反应特异地发生在核苷的5′位羟基上。产品经过DEAE-葡聚糖凝胶柱层析分离纯化。利用纸层析、吸收光谱和酶学反应特征鉴定都证明合成的产品对于5′-核苷酸磷酸二酯酶具有专一性,可以用于5′-核苷酸磷酸二酯酶活性测定以及其同工酶谱分析。     

肉色链孢囊菌和桔橙指孢囊菌发酵液中化学成分的研究

采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等分离手段,利用波谱分析方法,分别对放线菌肉色链孢囊菌(Streptospor-angium carneum)与桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)发酵液中的化合物进行分离鉴定。从肉色链孢囊菌发酵液中分离得到3个化合物,分别鉴定为腺嘌呤核苷(1),2′-脱氧腺苷(2),5,7,4′-三羟基异黄酮(3)。从桔橙指孢囊菌发酵液中也分离得到3个化合物,分别鉴定为腺嘌呤核苷(1),5,7,4′-三羟基异黄酮(3),2′-脱氧尿嘧啶核苷(4)。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅳ.用改进的二酯法化学合成d-pCpCpCpA

用改进的二酯法化学合成了几个脱氧寡核苷酸片段(d-_pC_pC,d-_pC_pC_pC,d-_pC_pC_pC_pA)。改进的主要之点是:(1)全部脱去保护基后柱分离,以克服在柱分离时寡核苷酸的保护基引起的亲脂性;(2)对所需的寡核苷酸片段重上适当的保护基,以作下一步的合成之用,于是避免了原先二酯法的操作中保护基的不希望有的丢失。用改进二酯法获得的寡核苷酸,产率和纯度得到提高和改善。虽然此改进目前仅用来合成寡核苷酸短片段,但可能提供用3′-5′磷酸二酯键方式连接两天然DNA短片段的途径。     

多核苷酸合成的研究 改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-(an)C或d-_(tb)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩台,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz_(?)T(?)T(?)C~(An)A~(Bz)(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的结果。     

多核苷酸合成的研究——改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸 d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-_(an)C 或d-_(ib)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩合,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz)(?)T(?)T(?)C~(An)A~(B(?))(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)(?)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的结果。     

脑啡肽基因的合成——Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成和三个片段,然后由脱去5'-Dmt基后依次同和向5'端延伸缩合得到产物和是通过和分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3'-OH进行磷酰化得到。则是由同反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短柱层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5'-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

多核苷酸合成的研究——Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGPUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。Hou(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)G~(Ac)(OAc)-p或_(MMT)G~(iHu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5′-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_5。_(HO)U(OBz)p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(HO)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7世尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCp--GpUp0产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。     

甲基乙烯基醚和2′(3′)-0-甲氧乙基-5′-核糖核苷二磷酸的合成

本文报导了一种制备甲基乙烯基醚(MVE)的简易方法,其合成反应途径是: 在三氟乙酸催化作用下,MVE与各种5′-核苷二磷酸(ppN)反应,用纤维素柱层析方法分离反应产物,制备了五种2′(3′)-O-甲氧乙基-5′核苷二磷酸(ppN-2′(3′)-O-ME):ppA-2′(3′)-O-ME,ppG-2′(3′)-O-ME,ppC-2′(3′)-O-ME,ppU-2′(3′)-O-ME,以及ppΨ-2′(3′)-O-ME,产率一般为50～70%。     

苦参内生真菌BS002菌株有效代谢产物的分离及结构鉴定

本论文采用硅胶柱层析的方法,以苦参内生真菌BS002菌株为研究对象,对BS002菌株的有效代谢产物进行了分离,并最终得到两种有效活性成分。论文确定了有效产物提取分离的最适温度为40℃、pH为5。柱层析分离选用硅胶(GF254)为固定相,CHCl3∶CH3OH=5∶1为流动相进行,并经TLC生物自显影法跟踪生物活性物质,最终产物经浓缩、冻干,利用HPLC、IR、GC-MS等方法确定其分别为:1,2-苯二甲酸丁基环己基酯,1,2-苯二甲酸-单(2-乙基己基)酯。     

多聚核苷酸的合成与研究——Ⅵ.用于DNA无性繁殖研究的八脱氧核苷酸EcoRI接头的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了带保护基的八脱氧核苷酸 dMMTr GpGpApApTpTpCpCp。B_2B_2B_2B2 AnAn脱去保护基后,经葡聚糖G-50凝胶过滤和7M尿素柱层析分离和纯化,得到双链的完全自身配对的八脱氧核苷酸 5′G—G—A—A—T—T—C—C—3′ 3′C—C—T—T—A—A—G—G—5′。经双向同系层析分析,核苷酸排列顺序符合实验设计要求。用Eco RI酶处理后,可以降解成小片段。     

红树植物老鼠簕内生真菌Aspergillus flavipes AIL8化学成分的研究

利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析及半制备高效液相色谱等分离手段对红树林老鼠簕内生真菌Aspergillus flavipes AIL8的提取物进行分离纯化,并利用各种波谱方法,结合文献对照,确定化合物结构。从提取物中分离得到6个化合物,经鉴定为4-羟基-3-甲氧基-5-[(2E,6E)-3,7,11-三甲基十二烷-2,6,10-三烯-1-基]苯甲酸(1)、芳香类内酯化合物(2)、一癸酸甘油酯(3)、菜子甾醇(4)、7,22(E)-麦角二烯-3β,5α,6β-三醇(5)和麦角甾-6,22-二烯-5α,8α-环二氧-3β-醇(6)。6个化合物均为首次从红树林老鼠簕内生真菌A.flavipes AIL8中分离得到,其中化合物1为新天然产物。     

可溶性核糖核酸的研究 Ⅲ.酵母可溶性核糖核酸中抗碱二核苷酸的分离与鉴定

利用Tomlinson和Tener的DEAE-纤维素柱层析方法,我们从酵母SRNA的碱水解产物分得抗碱二核苷酸的层析峰。将抗碱二核苷酸混合物用大肠杆菌碱性磷酸单酯酶处理后,纸层析分离可得到四个部分,分别称A_1,A_2,A_3及A_4。经鉴定A_1为2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(G'pG),A_2主要为2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷(C'pG,纯度约为87%),A_3则至少合2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(C'pA)和2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷(G'pA),A_4较为复杂,未最后鉴定。因此酵母SRNA中至少含有下列四种抗碱二核苷酸:2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(G'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-鸟便嘌呤核苷酸(C'pGp),2′-O-甲基胞嘧啶核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(C'pAp)及2′-O-甲基鸟便嘌呤核苷-3′-磷酸-5′-腺嘌呤核苷酸(G'pAp)。除此以外,还得到核苷二磷酸的层析峰,其中主要为鸟便嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸,只有少量的腺嘌呤核苷-2′(3′),5′-二磷酸。     

丽江蚤缀的化学成分

利用DiaionHP20及硅胶柱层析进行化合物的分离,从乙酸乙酯萃取部位分离得到了8个化合物,借助多种光谱技术进行结构鉴定分别鉴定为E对甲氧基肉桂酸(pEMethoxycinnamicacid)(Ⅰ),Z对甲氧基肉桂酸甲酯(3(4Methoxyphenyl)2Zpropenoicacidmethylester)(Ⅱ),Z对甲氧基肉桂酸(pZMethoxycinnamicacid)(Ⅲ),E对羟基肉桂酸甲酯(pEHedroxycinnamicacidmethylester)(Ⅳ),2,4,6,4′fourhydroxydihydrochalcone(Ⅴ),5,7,4′三羟基3′,5′二甲氧基黄酮(Ⅵ),β谷甾醇(βSidosterol)(Ⅶ),胡萝卜苷(Daucosterol)(Ⅷ)。所有化合物均为已知化合物,并首次从该植物中分得。     

大苞鞘石斛化学成分研究

通过硅胶柱层析、纯化,从大苞鞘石斛中分离得到5个化合物,利用理化性质和波谱分析分别鉴定为钩状石斛素(1)、愉悦石斛素(2)、4',5,7-三羟基-3′,5′-二甲氧基黄烷酮(3)、β-胡萝卜苷(4)和β-谷甾醇(5).所有化合物均为首次从大苞鞘石斛中分离得到.     

千里香化学成分研究CSCD

研究千里香的化学成分。采用硅胶、ODS、Sephadex LH-20、制备液相等多种色谱分离技术进行分离纯化,通过波谱数据分析进行结构鉴定。从千里香70%乙醇提取物中分离得到26个化合物,分别鉴定为千里香脂素(1)、8-去甲基川陈皮素(2)、ficusal(3)、lariciresinol-4′-monomethy ether(4)、(±)-5′-methoxy-4′-O-methyllariciresinol(5)、diospyrosin(6)、(-)-9′-O-E-feruloyl-lyoniresinol(7)、7-O-methylphellodenol-B(8)、欧芹烯酮酚甲醚(9)、3,4′-二羟基-3′,5′-二甲氧基苯丙酮(10)、4′-羟基-5,7-二甲氧基二氢黄酮(11)、5-羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基二氢黄酮(12)、4′-羟基-5,7,3′-三甲氧基二氢黄酮(13)、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基二氢黄酮(14)、2′,4-二羟基-3′,4′,6′-三甲氧基查尔酮(15)、2′,3-二羟基-4,4′,6′-三甲氧基查尔酮(16)、楝叶吴萸素B(17)、2′-羟基-3,4,5,4′,6′-五甲氧基查尔酮(18)、2′-羟基-3,4,4′,6′-四甲氧基查尔酮(19)、5,8-二羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄酮(20)、3′-羟基-5,6,7,8,4′,5′-六甲氧基黄酮(21)、5,3′,5′-三羟基-7,4′-二甲氧基黄酮(22)、5,7,3′-三羟基-8,4′-二甲氧基黄酮(23)、3′-羟基-5,6,7,4′-四甲氧基黄酮(24)、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮(25)、5-羟基-6,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮(26),其中化合物1、2为新化合物,化合物3~8、10~13、15、16、20~24为首次从九里香属植物中分离得到,化合物17为首次从千里香中分离得到。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5’-半分子顺序14～22九核苷酸的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子中二氢尿嘧啶环区的九核苷酸AGDCGGGDAG的合成工作。合成的方案是采用先合成AGD、CGG和DAG三个三核苷二磷酸片段,然后再以AGD pCGGDAG(3 p6)或AGDCGG pDAG(6 p3)两种方式用T_4RNA连接酶连接成为所需要的九核苷酸。CGG和DAG是采用磷酸二酯法进行化学合成,AGD是用AG>P同D借核糖核酸酶N_1酶促合成。这个路线的优点是三个三核苷二磷酸片段易于大量合成制备,无论是3 p6或6 p3两条路线的中间产物AGDCGG(产率61%)和CGGDAG(产率64%)和最终的九核苷酸产物都能得到好的连接产率和分离纯度。3 p6和6 p3两条路线所得的九核苷酸的连接产率分别为52%和82%。合成的产物均经过毗邻分析,5′末端~(32)P标记后的电泳-同系层析双向纯度鉴定或凝胶电泳以及核苷酸顺序分析证明了合成产物的均一性和结构的正确性。     

新疆甘草化学成分研究

从新疆甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)根中分离得到5个化合物,分别鉴定为:槲皮素(1)、甘草次酸(2)、阿魏酸(3)、5,7,3′,4′-四羟基-7-葡萄糖基二氢黄酮醇(4)、8,5′-二羟基3′α-鼠李糖黄酮(5)。其中化合物4,5为首次从该植物中分离得到。     

粗糙肉齿菌子实体化学成分研究

利用硅胶柱层析、RP-8层析及Sephadex LH-20分离的方法,从高等真菌粗糙肉齿菌(Sarcodon scabrosus)干燥子实体的甲醇提取物中分离并鉴定了8个化合物,经现代光谱技术鉴定分别为苯甲酸(1)、麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(2)、2',3'-二乙酰基-3,4,5',6',4″-五羟基-对联三苯(3)和1-乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、对羟基苯甲酸(5)、丁二酸(6)、腺嘌呤(7)、腺嘌呤核苷(8).以上化合物均为首次从粗糙肉齿菌中获得.     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅳ.用改进的二酯法化学合成d-pCpCpCpA

用改进的二酯法化学合成了几个脱氧寡核苷酸片段(d-pCpC,d-pCpCpC,d-pCpCpCpA)。改进的主要之点是:(1)全部脱去保护基后柱分离,以克服在柱分离时寡核苷酸的保护基引起的亲脂性;(2)对所需的寡核苷酸片段重上适当的保护基,以作下一步的合成之用,于是避免了原先二酯法的操作中保护基的不希望有的丢失。用改进二酯法获得的寡核苷酸,产率和纯度得到提高和改善。虽然此改进目前仅用来合成寡核苷酸短片段,但可能提供用3’-5’磷酸二酯键方式连接两天然DNA短片段的途径。