光系统п核心天线复合物CP43和CP47结构与功能研究进展

ＣＰ４３和ＣＰ４７是构成光合生物内周天线的两个重要的色素蛋白复合物,在生物体内主要起着传递激发能的作用。最近,大量研究证明,它们在放氧等过程中也起着重要作用。因此,近年来人们借助各种先进的研究技术对它们的结构进行了探讨,以揭示它们行使不同生理功能的分子机理。分子生物学技术可以使人们在整体水平上研究蛋白复合物的结构与功能,因此是一个非常有用的研究手段。本文即对近年来人们通过分子生物手段,以蓝藻为转化     

光系统II核心天线复合物CP43和CP47结构与功能研究进展

CP43和CP47是构成光合生物内周天线的两个重要的色素蛋白复合物,在生物体内主要起着传递激发能的作用。最近,大量研究证明,它们在放氧等过程中也起着重要作用。因此,近年来人们借助各种先进的研究技术对它们的结构进行了探讨,以揭示它们行使不同生理功能的分子机理。分子生物学技术可以使人们在整体水平上研究蛋白复合物的结构与功能,因此是一个非常有用的研究手段。本文即对近年来人们通过分子生物学手段,以蓝藻为转化材料,通过基因定点突变技术对CP43和CP47结构和功能的研究结果进行了全面综述,并进行了点评和分析,从而提出了一些新问题,为人们进行深入研究提供了详尽的研究资料和建设性的思路。     

盐酸胍诱导CP43和CP47变性的太赫兹时域光谱技术研究

太赫兹时域光谱技术(THz-TDS)是近年来新兴的一种研究分子构型状态的技术. 把这项技术运用到两种光合膜蛋白CP43和CP47的研究上, 研究结果表明, 运用太赫兹时域光谱技术能有效地把具有相似结构的蛋白质区分开来, 这项技术也是监测蛋白质变性的一种有力工具. 在盐酸胍(GuHCl)作用下, CP47和游离叶绿素a(Chl a)的太赫兹(THz)振幅谱中都出现一个明显的位于1.8 THz处的峰. 我们认为这个峰来自于叶绿素a和盐酸胍的相互作用. 和CP43相比, CP47中的叶绿素a更易于和盐酸胍发生作用.     

光系统II核心天线CP43和CP47的分离纯化及光谱性质研究

采用ＤＥＡＥ－ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＳＫ６５０２阴离子交换树脂柱层析法从菠 菜中分离纯化了ＰＳＯⅡ核心天线复合物ＣＰ４３和ＣＰ４７,计算出每分子ＣＰ４３含１９－２０个Ｃｈｌａ和４－５个β－Ｃａｒ;     

光系统II核心天线CP43和CP47的分离纯化及光谱性质研究

采用ＤＥＡＥ－ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＳＫ６５０Ｓ阴离子交换树脂柱层析法从菠菜（ＳｐｉｎａｃｉａＯｌｅｒａｃｅａ）中分离纯化了ＰＳＩＩ核心天线复合物ＣＰ４３和ＣＰ４７,计算出每分子ＣＰ４３含１９－２０个Ｃｈｌａ和４－５个β－Ｃａｒ;每分子ＣＰ４７含２０－２１个Ｃｈｌａ和３－４个β－Ｃａｒ。普通及三维（３Ｄ）低温（７７Ｋ）荧光发射光谱的测定证明,纯化的ＣＰ４３和ＣＰ４７都具有较好的完整性。常温（２９８Ｋ）吸收光谱的测定,证明纯化的ＣＰ４３和ＣＰ４７的红光区最大吸收峰分别位于６７１ｎｍ和６７４ｎｍ,但是它们在该区的四阶导数光谱均给出６７０ｎｍ和６８２ｎｍ两个峰,这表明,它们均至少含有两种不同结合状态的Ｃｈｌａ分子。对ＣＰ４３和ＣＰ４７中可能的能量传递机制进行了讨论     

多表位hCG嵌合肽(CP1和CP10)抗原的构建及其免疫原性

本研究设计了CP1和CP10两种嵌合肽免疫原,它们由人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β- hCG)3个线性B细胞表位(BCE)以及包括来自乙肝表面抗原和破伤风类毒素2个广谱性T细胞表位(TCE)的6个TCEs组合而成。编码CP1及其衍生物CP10的人工基因分别重组插入热诱导pBV221载体后,均能在大肠杆菌中以约占细菌总蛋白1％的比例被表达。在蛋白印迹试验中,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上显示约为16．5 kD分子量的CP1和CP10表达蛋白,能被抗各插入表位单克隆或多克隆抗体识别。各表达蛋白可用制备性PAGE方法一步纯化,纯化产物均显示95％以上的电泳均一性,纯化得率可达到每升培养液1-2mg水平。以它们为抗原主动免疫小鼠,都能分别产生识别CP1或CP10和天然β-hCG的抗血清,并都能在它们的抗血清中检测到各插入抗原表位的抗体。hCG CPs的可获得性及其能诱导各表位抗体生成特征,有可能成为研制hCG抗生育和肿瘤治疗性疫苗的新的候选免疫原。     

转MDMV CP基因玉米植株的再生

用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米自交系综31幼胚诱导的愈伤组织中,在含有Bialaphos 6 mg·L^-1的选择培养基上经过3个月的抗性筛选,抗性愈伤组织在分化培养基上生成可育再生植株。PCR、PCR-Southern blot及DNA点杂交结果表明,外源基因已导入到玉米基因组中。转基因T1和T2代植株在大田表现出对MDMV的抗性,可以降低发病率,减轻发病程度。     

The relative cellular levels of CP2a and CP2b potentiates erythroid cell-specific expression of the α-globin gene by regulating the nuclear localization of CP2c

CP2b activates α-globin expression in an erythroid cell-specific manner, through interaction with CP2c and PIAS1. Although CP2a is identical to CP2b except for lacking an exon encoding additional 36 amino acids and has the intrinsic DNA binding and transactivation properties, it does not exert any role in α-globin expression. Investigation of subcellular localization of exogenous CP2 proteins revealed that CP2a and CP2b were exclusively localized in the cytosol and nucleus, respectively. The CP2b-specific exon was in charge of the nuclear localization of CP2b. Interestingly, subcellular localization of CP2c was either in the nucleus or cytosol depending on the relative level of CP2a and CP2b although CP2c intrinsically localized in the cytosol in the absence of CP2a/CP2b. Finally, dramatic increment of hemoglobin expression was correlated with nuclear translocation of CP2c during MEL cell differentiation. Our data suggest that CP2b potentiate erythroid cell-specific α-globin expression by recruiting CP2c into the nucleus.     

纯化光系统Ⅱ（PSⅡ）核心天线复合物CP43和CP47的共振拉曼光谱

采用ＤＥＡＥ－ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＳＫ６５０Ｓ阴离子交换树脂柱层 从菠菜中分离纯化了ＰＳⅡ核心天线复合物ＣＰ４３和ＣＰ４７。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ）检测结果表明,纯化的ＣＰ４３和ＣＰ４７均只含１条蛋白带,证明样品纯度的可靠性。其常温（４６０－５００ｎｍ）较ＣＰ４３具有明显的精细结构。同时测定了它们的常温共振拉曼光谱,可以看出;类似于全反式构型的β－ｃａｒｏｔｅｎｅ分子,ＣＰ４３和ＣＰ     

Kinetic Fluorescence Spectral Analysis of Core Antennas CP43 and CP47 of Photosystem Ⅱ with Ultrafast Time-resolved Technology

Ultrafast time-resolved fluorescence experiments have been performed with core antennas CP43 and CP47 of PS Ⅱ. Their dynamic fluorescence spectra were obtained with excitation wavelength 514.5 nm. For CP43, the emission spectrum was found to be from 640 to 780 nm with a peak at ～680 nm and the lifetime of fluorescence was 3.54 ns. For CP47, the emission spectrum was from 630 to 775 nm with a peak at ～691 nm and the fluorescence lifetime was 3.22 ns. The fluorescence emission efficiencies of Chl a in CP43 and CP47 were calculated to be approximately 38.3% and 40.6%, respectively. The energy transfer from β-Car to Chl a in CP43 and CP47 was discussed. The rates of energy transfer from β-Car to Chl a were measured to be about 9.6×1011 s-1 and 1.3×1012 s-1 and energy transfer efficiencies 47.5% and 66.5% respectively. The edge-edge distances between β-Car and Chl a in CP43 and CP47 were estimated to be ～0.110 nm and ～0.085nm respectively.     

抗菌肽CP10A在大肠杆菌中的融合表达

CP10A是一种由抗菌肽Indolicine经过序列改造,且对多数革兰氏阳性病源细菌具有较强抗菌活性的多肽序列。本研究根据已报道的CP10A氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计CP10A的核苷酸序列,利用PCR技术合成相应的DNA序列,后克隆构建重组表达载体pET32a（+）-CP10A,转入大肠杆菌AD494菌株。经IPTG诱导表达和15% SDS-PAGE电泳检测后发现产物以包涵体形式存在,且融合表达量占总蛋白的50%。在变性条件下经Ni-NTA亲合柱层析及复性,最终获得了较高纯度的可溶性重组蛋白。本研究首次实现了CP10A抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达,为进一步研究其生物学活性及应用奠定了一定的基础,同时也为研究抗菌肽表达提供了一种方法。     

转WMV-2 CP基因黄瓜植株的再生

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体 ,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的转基因系统。农杆菌菌株为LBA44 0 4,内含双元载体pBPMWMV。该质粒载体带有一个npt Ⅱ基因 (筛选具有卡那霉素抗性的植株 )和一个WMV 2CP基因。抗卡那霉素 (Kanr)的黄瓜植株经DNA分子点杂交、PCR检测以及Southernblot证实 ,外源的WMV 2CP基因确实已导入黄瓜细胞且能稳定地遗传到子一代。对WMV 2CP基因在子一代的分离进行了统计。获得的转基因子一代植株对WMV 2表现出较强的抗性 ,可以延迟发病时间 ,减轻发病程度     

大豆花叶病毒CP基因原核表达与抗血清制备

根据已报道的大豆花叶病毒(SMV)序列设计引物,扩增SMV的外壳蛋白(CP)基因,序列同源性分析结果表明,与目前已报道的SMV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为85.0%～96.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为87.9%～98.9%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose 亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1∶ 3 800的一抗,可用于田间SMV病样检测.     

利用超快时间分辨技术对光系统Ⅱ核心天线CP43和CP47的动力学荧光光谱的分析

采用超快时间分辨荧光光谱装置对光系统Ⅱ核心天线CP43和CP47进行了研究 ,并在 5 14.5nm激光激发下获得了它们的动力学荧光光谱。CP43和CP47的荧光光谱范围分别为 6 40～ 780nm和 6 30～ 775nm ,并且它们分别在约 6 80nm和 6 91nm处有最大峰 ,在这两个峰值处的荧光寿命分别约为 3.5 4ns和 3.2 2ns。通过理论计算认为在CP43和CP47中 ,叶绿素a的荧光发射效率分别约为 38.3%和 40 .6 %。讨论了类胡萝卜素到叶绿素a分子的能量传递 ,认为在CP43和CP47中 ,类胡萝卜素到叶绿素a分子的能量传递时间常数分别为 9.6× 10 11s-1和 1.3× 10 12s-1,能量传递效率分别为 47.5 %和 6 6 .5 % ,并且估计在这两种核心天线中 ,类胡萝卜素分子和叶绿素a分子的外周间距分别约为 0 .110nm和 0 .0 85nm。     

康宁木霉CP88329纤维素酶产生条件的研究

从生霉棉布上分离出的康宁木霉ＣＰ８８１０５经诱变处理,获得一株高产纤维素酶的突变株ＣＰ８８３２９。在固体培养基上,２８℃培养７２小时,所产纤维素酶固体曲,以羧甲基纤维素钠为底物酶活力为４８８０ｕ／ｇ;以脱脂棉为底物酶活力为４８０ｕ／ｇ。产酶活力水平均为出发菌的３倍。酶在脱脂棉上作用最适条件为ｐＨ４．５－５．０,４５－５０℃;４５℃保温４ｈ,ｐＨ稳定范围为３．５－６．５;６０℃保温１ｈ,酶活力剩余２０％。酶可用于苎麻布抛光处理和牛仔服“石磨”处理。     

甘蔗花叶病毒CP基因的高效表达和抗血清制备

将甘蔗花叶病毒的CP基因克隆到表达载体pET22b( ),并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,表达蛋白约占总蛋白的15％。用此蛋白制备了效价高专化性强的抗体。此方法可以解决制备马铃薯Y病毒属病毒的血清时遇到的病毒提纯产量低和寄主蛋白影响等问题。     

黄瓜花叶病毒CP基因原核表达及抗血清的制备

把黄瓜花叶病毒 (CMV)西番莲分离物的外壳蛋白 (CP)基因 ,通过BamHI SacI位点定向插入pET 2 2b( )载体 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导下 37℃培养 6h ,SDS PAGE电泳示表达蛋白分子质量为 31 8kDa ,表达量占菌体总蛋白的 2 8 9%,表明该蛋白得到了高效表达。用冰冷的氯化钾溶液显色 ,用表达的特异蛋白质条带制备抗原 ,免疫家兔制备出病毒特异抗血清。采用ID ELISA测定抗血清效价为 1 0 -6;抗血清和CMV几个分离物均有特异反应 ,和TMV、菌体蛋白不发生非特异性反应 ;检测病毒灵敏度达 30ng ml,能够从稀释 31 2 5倍的感病植物汁液中检测出病毒     

膨化对转基因豆粕CP4-EPSPS蛋白的影响

旨在研究转基因豆粕经挤压膨化后外源蛋白的变化规律.以CP4-EPSPS多克隆抗体和转基因含量为2％的大豆标准品作为材料,建立ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4-EPSPS蛋白的方法.结果表明,膨化豆粕中外源蛋白含量随着温度和含水率的升高逐渐降低,ELISA法检测低限达到0.25％,可以定量检测经过加工的转基因豆粕.     

转WMV—2CP基因黄瓜植株的再生

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体,通过叶盘转移化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的转其因系统。农杆菌菌株为ＬＢＡ４４０４,内含双元载体ｐＢＰＭＷＭＶ。该质粒载体带有一个ｎｐｔ－Ⅱ基因（筛选具有卡那霉素抗性的植株）和一个ＷＭＶ－２ＣＰ基因。抗卡那霉素（Ｋａｎ＾ｒ）的黄瓜植株经ＤＮＡ分子点杂交、ＰＣＲ检测以及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ证实,外源的ＷＭＶ－２ＣＰ基因确实已导人瓜细胞且能稳定地遗传到子一代。     

CP4-EPSPS转基因棉花植株鉴定方法比较分析

CP4-EPSPS是从土壤农杆菌CP4菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因,是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因。但是在CP4-EPSPS转基因植物后期筛选过程中仅凭简单的草甘膦抗性筛选并不能得到完全准确的鉴定结果,常会出现假阳性或漏选的情况。本研究以抗草甘膦转CP4-EPSPS基因棉花为材料,对PCR扩增、ELISA、CP4-EPSPS蛋白检测试纸条及草甘膦抗性四种转基因阳性植株筛选方法进行比较,从筛选结果的准确性、时效性、易用性及实惠性等不同方面综合分析了各种筛选方法的优缺点,结果表明ELISA、试纸条检测方法的准确性显著高于PCR检测与0.3%浓度草甘膦抗性检测,而试纸条检测操作更加便捷,因此建议将草甘膦抗性与试纸条检测方法结合起来使用。本研究结果为以CP4-EPSPS基因为标记筛选的转基因植物的室内及大田筛选提供实验依据。