从表型到功能——p38α基因敲除小鼠的表型分析新进展

基因敲除技术的广泛应用, 极大地推动了后基因组时代对于基因功能研究的进程. 近年来, 对于有丝分裂原激活的蛋白激酶家族成员之一——p38α的基因敲除小鼠的研究, 在过滤“噪音”, 真实、清晰地揭示敲除基因的体内功能等方面极具典型意义. 对于其有关表型分析最新研究进展的回顾说明: 在精心设计及其表型的周密分析前提下,基因敲除技术的合理运用, 对于全面阐释重要信号分子的体内功能, 推动功能基因的研究进程具有极其重要的意义.     

淋巴细胞活化基因-3敲除(Lag-3~(-/-))小鼠构建及初步表型分析

目的构建淋巴细胞活化基因-3(Lag-3)基因敲除小鼠,初步分析Lag-3基因敲除对小鼠表型影响,为后续Lag-3体内功能研究提供动物模型。方法利用CRISPR/Cas9技术结合受精卵显微注射构建敲除小鼠,通过分子鉴定筛选基因敲除阳性小鼠,利用RT-PCR和流式检测方法进一步验证Lag-3基因敲除小鼠体内Lag-3基因敲除效果;通过建立Con A诱导的肝损伤模型研究Lag-3基因在体内的功能。结果 PCR和产物测序结果显示,获得了exon 2缺失的Lag-3基因敲除小鼠;该基因敲除纯合子小鼠(Lag-3~(-/-))经刀豆蛋白(Con A)刺激后,小鼠心脏、脾、肺、巨噬细胞和淋巴结中仅能检测到Lag-3 mRNA本底表达信号,小鼠巨噬细胞、脾细胞和淋巴结中仅能检测到非常低数量的Lag-3阳性细胞。表型分析发现,Lag-3基因的缺失显著减少了Con A诱导的小鼠外周血、骨髓和脾CD3+T细胞的数量,减轻了Con A诱发的急性肝损伤情况。结论成功构建Lag-3基因敲除小鼠模型,肝损伤过程中的体内功能研究显示,Lag-3缺失可以显著缓解Con A引发的肝损伤的发生。     

SHBG基因敲除小鼠模型的建立及其表型分析

目的:建立性激素结合球蛋白(SHBG)基因条件敲除小鼠模型,为探讨胎盘组织中SHBG在体内的生理功能及其与妊娠期糖尿病发病关系提供实验手段。方法:首先运用生物信息学手段确定小鼠SHBG基因组序列,构建SHBG打靶载体,以电穿孔方法将其导入小鼠ES细胞,筛选培养阳性ES细胞并行PCR鉴定,并将正确同源重组的ES细胞注射进小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫;将获得的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配,筛选后获得Flox小鼠,该小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠杂交,子代多次自交获得SHBG全身基因敲除(SHBG~(-/-))的小鼠。结果:运用同源重组及ES细胞技术建立了SHBG基因的Flox小鼠,并利用Cre/Loxp重组酶系统建立了SHBG基因全身敲除小鼠模型,PCR方法从基因水平证明了SHBG基因Flox小鼠及SHBG基因全身敲除小鼠模型建立成功。对基因敲除鼠进行初步表型分析发现:SHBG基因全身敲除小鼠的生长发育与野生型小鼠相比无明显肉眼所见异常,SHBG基因全身敲除雌雄小鼠均具有生殖能力。结论:成功建立SHBG基因全身敲除小鼠模型,通过对基因敲除鼠进行初步表型分析,发现SHBG基因全身敲除小鼠外观上发育正常,为进一步研究SHBG在妊娠期糖尿病中的作用奠定了基础。     

p53基因敲除大鼠模型的构建及表型分析

使用TALEN技术制作p53基因敲除大鼠模型,建立种群并分析大鼠表型。设计特异性识别p53基因外显子2的TALEN蛋白并构建相应载体,将体外转录的TALEN m RNA注射SD大鼠受精卵,出生后从仔鼠中通过测序筛选靶位点正确剪切的阳性小鼠。结果显示,注射得到11只新生仔鼠,通过测序发现其中有10只靶位点发生剪切。选取其中4只作为首建鼠进行繁殖。p53基因敲除纯合子表现出肿瘤易发性,主要自发性肿瘤类型为恶性纤维组织肉瘤。此外,p53基因敲除纯合子大鼠表现出眼睛发育异常,视网膜变性及晶状体纤维排列紊乱。通过TALEN技术高效地获得了p53基因敲除大鼠模型,纯合子敲除大鼠除了易发肿瘤并伴有眼发育异常,因而该敲除大鼠模型除了可用于研究肿瘤发生机制外,也可用于研究p53基因在眼发育过程中的功能。     

GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步.条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异.通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础.     

RNAi 在植物功能基因组中的应用

植物生物学后基因组时代的主要目标就是确定植物基因组中所有基因所具有的功能。解决这个问题的一个最直接的方法就是还原或者敲除某个在正常条件下其功能能表达出一定的可观察到的表型的特殊基因。对于这方面的研究,插入突变技术就是一个可用的工具,但是基因的随机性,致死敲除,无标记的突变体都大大地限制了这种技术的利用。RNm技术可以克服以上那些难题。它已经被广泛地应用在线虫的功能基因组上,并且所获得的有效资源还被广泛地用于植物功能基因组的分析。     

水通道蛋白的生理功能 ——水通道基因敲除小鼠表型研究进展

水通道蛋白 (aquaporin, AQP) 是一族细胞膜上选择性高效转运水分子的特异孔道. 自从 Agre 等于 1992 年从红细胞膜发现第一个水通道蛋白 AQP1以来,有关水通道蛋白结构与功能的研究取得了迅速的、系列性的进展 . 已报道的哺乳动物 AQP 家族已有 11 个在蛋白质序列上有同源性成员 (AQP0~AQP10). AQP 在体内各系统组织中广泛表达,除了在与体液分泌和吸收密切相关的多种上皮和内皮细胞高表达外,在一些与体液转运无明显关系的组织细胞如红细胞、白细胞、脂肪细胞和骨骼肌细胞等处也有表达,提示 AQP 可能在多种器官生理和病理中发挥重要作用. 基因打靶技术是研究特定基因在体内生理功能的有力手段. 目前 AQP1、3、4、5 基因敲除和 AQP2 基因点突变的基因敲入小鼠模型 ( 模拟人类常染色体隐性遗传尿崩症 ) 已成功建立并广泛用于表型研究,在 AQP 水通道蛋白生理功能方面获得许多重要进展.     

Rett综合征相关基因MeCP2敲除大鼠模型的构建及分析

MeCP2(Methyl CpG binding protein 2)基因突变可导致Rett综合征(Rett syndrome, RTT)。目前已报道的MeCP2敲除小鼠表型与RTT病人症状存在显著差异。为探索MeCP2在脑发育中的作用及其导致RTT的机制,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了MeCP2基因敲除大鼠模型。通过构建靶向敲除MeCP2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠受精卵中,在MeCP2基因exon2中造成移码突变,从而获得MeCP2基因敲除大鼠。利用测序和Western blotting方法鉴定MeCP2敲除大鼠,并对其表型和行为学特征进行分析,发现MeCP2敲除大鼠体重降低,存在焦虑倾向和认知缺陷。本研究成功构建了MeCP2基因敲除大鼠模型,其表型类似人类RTT患者的症状,为后续MeCP2功能研究提供了更好的动物模型。     

MDMPR:小鼠发育代谢表型库

小鼠发育代谢表型库(Mouse Developmental and Metabolic Phenotype Repository,MDMPR)是一个致力于小鼠资源和表型数据实时共享的开放性平台,它依托于科技部重点研发计划“发育编程及其代谢调节”专项项目“建立小鼠发育代谢表型库”。该项目预计在5年内完成500个发育代谢相关小鼠敲除模型的建立,并对其表型数据进行标准化的解析、建立表型数据库。MDMPR作为一个资源及数据集成的库,由多个子系统作为支撑,包括ES细胞数据库、项目管理系统、繁育管理系统、精子库管理系统、表型分析系统,信息化管理深入到项目中每个环节,从基因突变ES细胞制备、基因突变小鼠制备、小鼠繁育,精子冻存到最终的表型分析、数据处理及展示,保证了MDMPR产生数据的真实性及实时性。MDMPR除了不断地推进项目进行,增加自身产生的数据外,也在积极的整合其他的资源及数据,如人特异性基因敲除ES细胞库、蛋白相互作用数据库(STRING)、核心转录调节环路(dbCoRc)和Enhancer-Indel数据库,今后还将进一步整合,帮助发育代谢及其他领域的研究人员能够一站式的获取所需资源和数据、加快研究进程,最终服务于全人类的医疗事业。     

Fancm基因敲除小鼠构建及其表型分析

目的构建范可尼贫血通路Fancm基因敲除小鼠,研究Fancm基因缺失对小鼠生理功能,特别是雄性生殖器官的影响。方法采用CRISPR/Cas9技术,获得Fancm基因敲除小鼠。分析FANCM蛋白在野生型和Fancm^-/-小鼠睾丸组织中的表达。统计Fancm^-/-小鼠的出生率、体重、性别比例及子代生育情况,分析血液常规指标。组织形态学研究雄性Fancm^-/-小鼠睾丸生理病理表型。结果敲除Fancm基因ATG区域,获得稳定遗传的C57BL/6背景Fancm^-/-小鼠。Fancm^-/-小鼠睾丸中FANCM蛋白表达完全丢失。Fancm^-/-小鼠无明显的胚胎致死现象,但雌性Fancm-/-小鼠数目显著少于雄性Fancm^-/-小鼠。同窝Fancm^-/-小鼠比较野生型体重无明显区别,部分血常规指标有显著性差异。Fancm^-/-小鼠有明显的生殖能力缺陷。雄性Fancm^-/-小鼠睾丸有显著的发育缺陷,其生精细胞凋亡增加、细胞周期阻滞,影响睾丸发育与精子的生成。结论成功获得稳定遗传C57BL/6背景Fancm^-/-小鼠,Fancm基因参与小鼠的生长发育,特别是雄性生殖器官功能的维持及调控。     

基因敲除与学习、记忆：现状、问题和展望

基因敲除技术的应用使学习、记忆分子机制的研究出现了新的突破.目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD有缺陷的基因敲除动物,发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少.然而,现有研究的一个较大问题是忽视了遗传背景基因在表型改变中的作用,被认为由突变靶基因造成的表型缺陷实际上可能是由背景基因而不是由突变基因造成的.要排除背景基因的作用,必须建立新的ES细胞,选择纯遗传背景的小鼠品系,并且在时间、范围和程度上对基因敲除进行精细的控制.     

CRISPR/Cas9高效敲除突触结合蛋白Ⅰ的电生理学研究

研究一种蛋白质在神经元中的功能,最有效的方法之一是在该基因敲除动物的神经元中确认其表型.传统的用胚胎干细胞建立基因敲除动物模型的方法虽然稳定,但是复杂、耗时.近几年来,一种新型基因组编辑技术——CRISPR/Cas9,能够在不分裂的神经元中高效特异地敲除目的基因.本文研究了用CRISPR/Cas9系统敲除突触结合蛋白Ⅰ(synaptotagminⅠ,Syt1)基因后的小鼠海马培养神经元的电生理学特性.我们设计并构建了Syt1单导向RNA(Syt1 sgRNA)的慢病毒载体质粒,并用编码Cas9和Syt1 sgRNA的慢病毒感染培养的小鼠海马神经元,急性敲除神经元中Syt1基因(Syt1 sgRNA组),并用不靶向任何基因的Scramble sgRNA感染神经元作为阴性对照(Scramble组).通过全细胞膜片钳的方法检测单动作电位诱发的兴奋性突触后电流(single AP-eEPSC)、微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)、高糖反应测量的即刻可释放囊泡池(RRP)以及10 Hz串刺激测量的囊泡释放概率(P_r).结果显示,Syt1 sgRNA组神经元丧失了Syt1的功能,并且与Syt1敲除(Syt1 KO)小鼠神经元的突触传递表型相似,而Scramble组神经元的各参数和野生型(WT)小鼠神经元相比没有显著性差异.本文为CRISPR/Cas9技术应用于神经元中基因的急性修饰提供了依据.     

去泛素化酶OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型的构建与表型分析

目的:建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型,初步分析其表型并研究OTUB1基因与肝脏代谢的关系。方法:利用Cre/Loxp系统构建条件性基因敲除小鼠模型,即将OTUB1~(fl/fl)转基因小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代自交,得到OTUB1肝特异性基因敲除小鼠并进行鉴定。取同窝对照小鼠(control,NC)和肝特异型基因敲除(hepatic-specific OTUB1 knockout,HCKO)小鼠,通过PCR和免疫印迹(Western blot),确证OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型是否成功构建。通过组织病理学方法,分析主要组织器官的形态以及是否存在自发的病变;通过血清生化指标检测肝脏脂代谢水平;通过血糖耐受实验(GTT)分析HCKO小鼠对血糖的控制。结果:基因组测序和Western blot检测结果显示HCKO小鼠肝脏中OTUB1被敲除,其他组织中OTUB1表达水平无变化,证明OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型构建成功。HCKO小鼠出生正常,各组织器官无异常,生化指标中总胆固醇水平明显降低,表明OTUB1影响肝脏脂代谢水平。糖耐受实验中HCKO小鼠血糖回落迅速,表明敲除OTUB1影响肝脏血糖调节稳态。结论:应用Cre/Loxp技术成功建立OTUB1肝脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究OTUB1在肝脏的生理功能和调控机制提供了重要的动物模型。     

冠突曲霉Fig基因敲除菌株的构建及表型分析

为了研究冠突曲霉(Aspergillus cristatus) Fig基因的功能,本研究采用同源重组的方法获得敲除株。并对敲除株进行功能验证。结果显示对Fig基因敲除株培养观察并与野生型菌株相比发现,在含有不同浓度NaCl的MYA培养基中,仍能产生成熟的子囊孢子和分生孢子,但分生孢子数量是野生型的1/4,子囊孢子数量是野生型的1/5,且敲除株菌落几乎没有渗出液,无皱褶,菌落表面干燥,色素产生量急剧下降,这些结果表明Fig基因对冠突曲霉产孢起正调控,本实验为冠突曲霉发育调控机制的研究提供了一定的技术基础。     

果蝇睾丸基因敲除突变体的构建及表型分析

生殖系统功能的正常维持是物种繁衍的基础,需要多基因协同作用,但其中许多基因的具体功能和作用机制并不清楚。本研究选取了果蝇(Drosophila melanogaster)中8个在睾丸中表达、功能未知且与人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)高度同源的基因(CG4161、CG11475、CG2921、CG10541、CG7276、CG3800、CG8117和CG16779),分析了它们在不同组织中的表达水平,并分别检测了它们在雄性生殖系统中的功能。在这8个基因中,前5个为睾丸优势表达基因,其余3个为全身性表达。首先,利用CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术结合同源定向修复(homology-directed repair, HDR)在果蝇中对8个候选基因逐一进行敲除,建立了纯合的基因敲除突变品系;然后对这些品系的雄蝇进行了生育力测试及睾丸细胞学观察。结果显示,CG7276和CG3800基因敲除果蝇出现部分雄蝇不育且可育雄蝇后代数量较野生型显著下降。睾丸解剖观察显示CG7276和CG3800的功能缺失可导致雄蝇分别出现不同程度的精囊缩小及精原干细胞减少和细胞分布混乱;染色结果也提示CG7276和CG3800在精子的成熟过程中发挥一定作用。其他6个基因突变并未导致雄蝇育性变化或睾丸形态异常。这些突变体的获得及表型的初步分析为进一步研究基因功能及机制提供了良好的动物模型及基础。     

Vps28基因敲除小鼠模型的构建及其对泌乳和免疫性状影响的研究

尽管基于QTL定位和关联分析研究挖掘了许多奶牛产奶性状候选功能基因,然而仅有少数几个基因经过体内外的功能验证.本课题组前期全基因组关联分析(GWAS)研究结果表明Vps28基因与奶牛产奶性状表型显著相关,并在奶牛乳腺组织中特异性高表达.为了深入了解该基因对泌乳性状的作用和功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了...     

基于CRISPR/Cas9技术构建Plin1基因敲除小鼠模型及表型分析

利用CRISPR/Cas9技术构建纯合围脂滴蛋白(Plin1)基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型.针对Plin1基因2号外显子前后序列设计sgRNA并构建表达载体,体外转录获得sgRNA后与Cas9蛋白混合,显微注射至小鼠受精卵中并进行胚胎移植.出生小鼠经测序及PCR基因型鉴定获得Fo代阳性小鼠;令Fo代小鼠与野生型小...     

尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究

由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害之一。Foc有4个小种,其中4号小种(Focr4)因其寄主范围广且无高抗病性的香蕉品种,对香蕉产业的危害最大,其致病机制至今尚不清楚。为研究其致病机制,本文对Focr4野生型菌株(Focr4-193-6)、因其T-DNA插入导致致病性严重减弱的突变体Focr4-1701、T-DNA插入标签基因敲除子△Focr4-1701及敲除基因互补子△Focr4-1701-cp-1为材料,从致病性测定、玻璃纸穿透试验、孢子形态观察、产孢量与孢子萌发率测定、粗毒素测定等方面对其与致病性相关的生物学表型进行了测定。结果表明:T-DNA插入突变体Focr4-1701和基因敲除突变体△Focr4-1701接种后的香蕉植株叶片没有表现发病症状,敲除基因互补菌株与野生型菌株一样表现出发病症状;T-DNA插入突变体和基因敲除突变体不能穿透玻璃纸生长,T-DNA插入突变体及基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率和产毒素能力上均极显著低于野生型菌株及互补菌株。这些表型性状差异说明Focr4-1701致病性严重减弱可能是T-DNA插入位点标签基因失活后导致了菌丝体侵染能力下降及产毒素能力降低造成的。     

RNAi技术研究进展

近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi,也译作RNA干预或者干涉)。研究表明它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具,可以毫不夸张地说,RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐,为此被SCIENCE评为2002年最重要的科研成果之一。     

Lesch-Nyhan综合征家兔模型的建立及其表型分析

Lesch-Nyhan综合征(Lesch-Nyhan syndrome,LNS)是一种先天性的嘌呤代谢缺陷病,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase,HPRT)是其主要致病基因,临床特征表现为尿酸分泌过多、痛风、肾结石及肾脏损伤等,目前致病机制尚未被完全阐明且无有效治愈手段。动物模型在疾病致病机理研究和治疗方式探索中发挥着重要功能。本研究采用高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术和显微注射的方式敲除家兔(Oryctolagus cuniculus)HPRT基因建立了LNS家兔模型,以期能更好的模拟该疾病的表型。首先针对兔HPRT基因第3外显子设计一条sgRNA,将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA共注射到兔受精卵中,注射后的胚胎移植到代孕母兔子宫中,待仔兔出生后对其基因型及表型进行鉴定与分析。共出生4只仔兔(分别编号为R1、R2、R3和R4),测序结果显示4只仔兔都产生了不同程度的基因修饰,基因编辑效率达100%,其中R4仔兔T载体测序结果在基因编辑靶点未检测到野生型序列。通过6-硫代鸟嘌呤(6-Thiogua...