噬菌体T4诱导的脱氧核糖核酸(DNA)连接酶的分离和纯化

本文介绍一个从噬菌体T4诱导的大肠杆菌中纯化DNA连接酶的简法。这是从同一起始原料(噬菌体T4感染的大肠杆菌菌体)同时提纯三种酶(多核苷酸激酶,DNA连接酶及RNA连接酶)的步骤的一部分。这个方法包括以下几步：超声破碎菌体,抽提粗酶,用硫酸链霉素沉淀去除多核苷酸激酶和DNA．甩I)EAE纤素素(DE-52)柱层折将DNA建接酶与RNA连接酶分离开来,用磷酸纤维素(P-II)分步冼脱DNA连接酶,对在Tris-HCI,pH7.6中含50％甘油的缓冲液透析加以浓缩。最终得到高浓度(5500单位／毫升)和高纯度酶制品。     

噬菌体T4诱导的核糖核酸(RNA)连接酶的分离和纯化

本文介绍了一种可以同时提取多核苷酸激酶(利用硫酸链霉素沉淀部分)DNA连接酶(DE一52柱层析峰I)和RNA连接酶(DE-52柱层析峰III)的方法。RNA连接酶的分离纯化步骤,除粗酶提取与DEAE纤维素柱层析两步与DNA连接酶的分离纯化方法一样外,以后只要再经过羟基磷灰石柱层析,葡聚糖凝胶(sc曲adex-G 100)过滤,和单链DNA琼酯糖凝胶亲和层析三步就可以达到纯化的目的。最终酶浓度达到每毫升24,800交换单位,即500个标准连接单位。用’H标记的聚腺苷酸作底物测不出Rnase杂酶活力,而且成功地应用于核糖十二核苷酸和十六核苷酸的定向合成。此外还做了一些初步的连接试验,表明RNA连接酶对受体寡核苷酸中戊糖是核糖还是脱氧核糖有较明显的专一性,对受体寡核苷酸的组成和顺序有一定的选择性。5'-脱氧胸腺嘧啶寡核苷酸d(pT)。也是个相当好的供体。     

大肠杆菌T4噬菌体DNA连接酶基因(G30)在无性繁殖系细胞中的表达

从T₄基因30的无性繁殖系细胞中,用一般提取T4 DNA连接酶的方法,分离纯化得到与T₄ DNA连接酶相同的酶。无论从它在DEAE-纤维素和磷酸纤维素柱上的层析行为,或从用T₄ DNA连接酶酶活标准测定法测定结果,都说明它与T₄ DNA连接酶是相同的,这就表明T4DNA连接酶基因(即基因30)在无性繁殖系的大肠杆菌细胞中已被表达。     

额外的错配碱基提高T4 DNA连接酶等位特异性连接

连接是一种主要的DNA处理过程。由于较低的商业成本以及核酸底物识别的灵活性,T4 DNA连接酶被广泛应用于生物分子工程,特别是特定核酸序列的等位特异性连接检测。本文评估了在T4 DNA连接酶介导的连接反应中,引入额外的错配碱基对所产生的影响。设计了超过150组DNA/DNA或DNA/RNA带有的额外错配碱基对的组合。结果发现,引入额外的错配碱基对后,T4 DNA 连接酶在DNA/DNA连接中特异性可提高60倍以上,而在DNA/RNA连接中特异性只能提高2倍。在等位特异性连接中,有的错配碱基对可使T4 DNA连接酶的特异性提高600多倍。     

额外的错配碱基提高T4 DNA连接酶等位特异性连接（英文）

连接是一种主要的DNA处理过程。由于较低的商业成本以及核酸底物识别的灵活性,T4DNA连接酶被广泛应用于生物分子工程,特别是特定核酸序列的等位特异性连接检测。本文评估了在T4 DNA连接酶介导的连接反应中,引入额外的错配碱基对所产生的影响。设计了超过150组DNA/DNA或DNA/RNA带有的额外错配碱基对的组合。结果发现,引入额外的错配碱基对后,T4 DNA连接酶在DNA/DNA连接中特异性可提高60倍以上,而在DNA/RNA连接中特异性只能提高2倍。在等位特异性连接中,有的错配碱基对可使T4 DNA连接酶的特异性提高600多倍。     

分子克隆中使用的其他酶(续)

用T_4多核苷酸激酶标记DNA5′端: T_4多核苷酸激酶(T_4感染E.coli)此酶催化ATP之r位磷转移到DNA或RNA的5′OH上的反应。     

大鼠脑cDNA文库的构建

采用简单高效的cDNA合成技术制备Wistar大鼠脑cDNA基因文库,以纯化的poly( A)⁺－RNA为模板,含Not I切点的oligo－（dT）15为引物,在反转录酶的作用下,合成第一股单链cDNA;用E.coli RNase H除去模板RNA,并以E.coli DNA聚合酶Ｉ,E.coli DNA连接酶和T4 DNA聚合酶催化合成cDNA第二条链,即成为双链cDNA;此双股cDNA除0．5μg用于插入pSPORT I载体,转入E.coli DH5a,建成cDNA文库外,其余保存在－20℃,以此cDNA为模板,应用PCR方法,先后克隆了谷氨酸脱羧酶（GAD,1800bp）、神经元特异性烯醇化酶（NSE,1340bp）,甲状腺激素受体（T3－receptor,1230bp）、胆囊收缩素（CCK,345bp）的全编码基因．     

DNA连接酶同工酶的研究进展

DNA连接酶是生物体内重要的酶,其所催化的反应在DNA的复制和修复过程中起重要作用. DNA连接酶分为两大类：一类是利用ATP的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖ATP的DNA连接酶,另一类是利用NAD⁺的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD^＋的DNA连接酶.研究发现,细菌的DNA连接酶都是依赖NAD^＋的, 且有非常相似的序列和相近的分子质量,其酶分子分为两个功能区：N端区与NAD^＋结合形成酶-腺苷酸中间物;C端区催化两条DNA链的连接.所有真核生物的DNA连接酶都是利用ATP提供能量,且一种真核生物含有多种DNA连接酶,不同的DNA连接酶催化不同的DNA修复和复制过程：DNA连接酶Ⅰ的作用是将岗畸片段连接起来形成完整的DNA链以及进行碱基切除修复(BER);DNA连接酶Ⅲ主要是在DNA修复中起作用,即催化单核苷酸碱基切除修复.DNA连接酶Ⅱ可能是DNA连接酶Ⅲ的一个片段.     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

自1972年Silber等入首先从T_4噬菌体感染的大肠杆菌中分离出RNA连接酶后,人们对分离纯化这种酶的工作进行了很大的改进。目前有些实验室已能制备较纯的T_4RNA连接酶,但方法比较繁琐,通常要经过六个层析牲才能得到较好的结果。甲此寻求一种简单有效的纯化方法是很有意义的。我们将免疫亲和层析用于T_4RNA连接酶的纯化,方法简便,同时所得到的酶测不到RNase的活性,可用于一定序列寡聚核糖核酸的合成。     

DNA生物催化功能研究进展

近年来发现 ,不少结构特殊的DNA分子分别具有剪切RNA分子或DNA分子、T4聚核苷酸激酶样活性、DNA连接酶样活性以及催化卟啉金属离子化等多种生物催化功能 ,这些DNA分子被称为脱氧核酶或酶性DNA .它们在用作RNA和DNA工具酶、基因分析和诊断手段以及基因治疗药物等方面的潜力引人注目 .综述这些DNA分子的种类、结构特征、催化活性及应用现状和前景等方面的最新研究进展     

一种简单快速回收DNA片段的方法——DE-81滤纸

琼脂糖凝胶电泳对于快速分离不同分子量的DNA片段是极为有效的,但把DNA片段从凝胶中回收回来有时要碰到一些困难,如回收的DNA易受凝胶中硫酸多糖的污染(该成分是许多酶的抑制剂,如内切酶、连接酶、激酶、聚合酶等);大片段DNA回收     

高中生物学“DNA分子复制”教学中的2点误区

误区1：DNA分子复制时不需要DNA连接酶。 例：下面哪种酶在遗传信息的传递和表达过程中不起作用（ ）。 A．DNA连接酶 B．DNA聚合酶 C．RNA聚合酶 D．解旋酶     

BamHI DNA甲基化酶的纯化及对BamHI限制性核酸内切酶限制作用的保护作用

用硫酸铵盐析、磷酸纤维素柱层析和肝素-Sepharose 4B亲和层析从解淀粉芽孢杆菌(Raviflus amyloliquefaciens)纯化了BamHI DNA甲基化酶。并以λDNA为底物,研究了λDNA被BamHIDNA甲基化酶作用后,对BamHI限制性核酸内切酶的切割产生了明显的阻抗作用。     

水稻4-香豆酸CoA连接酶的基本性质

用硫酸铵盐析,DEAE-纤维素柱层析的方法从水稻黄化幼苗中分离和初步纯化了4-香豆酸CoA连接酶同工酶。发现它们有着明显的底物特异性,其中同工酶Ⅰ对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸芥子酸均具有亲和性;而同工酶Ⅱ则只能对香豆酸、咖啡酸发生作用。4CL同工酶Ⅰ的最适pH在8.0左右,最适反应温度为40℃。     

DNA复制和表达过程中的“水”

遗传信息的传递和表达主要指DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译,属小分子单体物聚合成大分子物的过程。以文献、资料为依据,发现主要由DNA聚合酶、DNA连接酶和RNA聚合酶参与的DNA新链合成过程,由RNA聚合酶催化的RNA链延伸过程,以及由氨酰-tRNA酶、转肽酶等参与的肽链形成过程中均没有水的形成。     

DNA末端硫修饰依赖的体外大片段DNA连接法

【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中,DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰),而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有硫修饰识别结构域(sulfur-binding domain, SBD)的识别蛋白,可以特异性识别DNA上的硫修饰,这启发了我们发展出一种新的DNA组装技术。【目的】探究在DNA末端硫修饰的连接中,T4 DNA连接酶与SBD相融合蛋白和单独的T4 DNA连接酶相比,是否有更高的连接效率。【方法】根据同源重组原理,设计硫修饰引物,扩增硫修饰的DNA片段。构建T4 DNA连接酶与SBD融合蛋白的3种表达载体T4-linker-SBD(Hga)、T4-linker-SBD(Spr)和T4-linker-SBD(Mmo),表达纯化以上3种融合蛋白。比较3组浓度梯度(2.4、0.24、0.024 mg/mL) T4 DNA连接酶与融合蛋白在2.5 kb和8.0 kb DNA片段连接上的差异。【结果】DNA末端硫修饰的2.5kb和8.0kb的两端片段均能扩增,而且3种融合蛋白...     

2′-氟取代对T7 DNA连接酶连接效率的阻滞

为更好地理解连接酶的接合机制,研究了2′-氟取代核苷酸（2′-fluorinated nucleotide, FN）对T7 DNA连接酶接合特性的影响。利用分子信标的荧光信号变化来检测连接酶接合活性。结果显示,在连接酶作用的分子信标缺口处的5′端和3′端分别进行F取代时,对T7 DNA连接酶的接合效果分别阻滞（48.7±6.7）%和（70.6±4.0）%。在取代同时发生在5′端和3′端时,接合效果被阻滞（76.6±1.3）%。动力学参数的回归显示,FN取代会导致连接反应最大速率（Vmax）降低,同时导致米氏常数Km增大,说明酶和底物之间的亲和力在取代后减小。缺口两端的碱基错配也对酶接合反应效果产生一定的阻滞效应。本研究的结果和结论使对氟取代后,T7 DNA连接酶的接合特性有了更进一步的认识,为更好地应用T7 DNA连接酶接合活性提供有力的实用依据。     

一种嗜热耐酸古细菌JP2菌株编码的热稳定DNA连接酶的生物化学及酶学特性研究

对分离自巴布亚新几内亚地热活跃区的一种嗜热耐酸古细菌——JP2菌株中的DNA连接酶基因进行了克隆、表达、纯化,并对其生物化学及酶学特性进行了研究.对其核酸及氨基酸序列的分析表明:JP2菌株的DNA连接酶与古细菌种Sulfolobussolfataricus和Sulfolobusshibatae的DNA连接酶具有很高的同源性,尤其在与功能紧密相关的6个保守结构基序的一致性更高.JP2连接酶表现出高的DNA缺口连接活性,在二价金属辅因子的选择方面,JP2连接酶更倾向于Mn2 离子而不是Mg2 、Ca2 及其他离子.不同温度时的热稳定性测试显示:JP2连接酶在50～80℃时为较适连接温度,当温度不超过85℃时,连接酶的活性在5h内保持相对稳定,但在90℃以上活性则很快降低.还分离纯化了JP2的分子伴侣——TF55,并将其应用于增加JP2连接酶的热稳定性研究.结果表明:在体外85℃时,分子伴侣未增加连接酶的热稳定性,可能的原因是在85℃体外状态下TF55本身就表现出不稳定性.     

猪胸腺末端脱氧核苷酰转移酶的分离纯化及性质的研究

 本文报道了一种较简便的从猪胸腺中分离纯化末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)的方法。经一次磷酸纤维素柱层析,使TdT与DNA聚合酶分离;经三次柱层析,可获得SDS-电泳纯,分子量约60K的产品。其酶学性质与牛胸腺TdT相似。     

鲤鱼垂体mRNA反转录模板活性的研究

 本实验用不同方法研究鲤鱼垂体mRNA反转录为互补DNA的活性。用硫氰酸胍法,从垂体中提取总RNA,经过Oligo(dT)-纤维素柱层析,得到poly(A)~+RNA。 以mRNA为模板,30％反转录成单链cDNA。利用RNaseH-DNA聚合酶Ⅰ-E.coli DNA连接酶合成双链cDNA。单链cDNA拷贝成双链cDNA。经放射自显影分析,证明合成了全长cDNA。用水解法合成双链cDNA,大多数为不完整的双链cDNA。平末端的双链cDNA连接上Eco RI-linker经Sepharose-4B分离,收集大片段cDNA,与pUC 19载体相连接,经转化构建成10~5克隆/μg mRNA的cDNA文库。