从Staphylococcus aureus 307株分离的三个质粒在Bacillus subtilis Ki-2和168株中的表达和特性

Staphylococcus aureus 307株是临床分离的一多重耐药株,其中包括抗氯霉素(Cm~R),抗卡那霉素(Km~R)和抗四环素(Tc~R)。实验结果表明,这三种抗药性是分别为三个质粒所决定的。我们把它们分别称为pC307、pK307和pT307。通过转化把三个质粒引入Bacillus subtilis Ki-2和168株,获得Cm~R Km~R Tc~R转化体。本文研究了这些质粒所携带的抗药基因在Ki-2和168株中的表达,以及质粒在新宿主中的相容性和稳定性。     

枯草杆菌和大肠杆菌融合转移双复制功能杂种质粒pTZ22的研究

在大肠杆菌C600(pTZ22)(Km~rTc~rAp~r)和枯草杆菌Ki-2-132(Sm~rIle~-Thr~-Val~-)(简称A系统)以及在枯草杆菌Ki-2-132(pTZ22)(Km~r)和大肠杆菌C600(简称B系统)菌株之间,通过细胞融合,从两个方向转移pTZ22。A系统获得一批抗Km Sm融合子,B系统获得一批抗Km Ap和Tc的融合子,融合频率为10~(-4)—10~(-6)。融合子的抗性是稳定的,并且革兰氏染色、产酶和产孢匦与不带质粒的亲本相同。DNA的电泳图证明,除了不带质粒的亲本无质粒带外,其它菌株都有质粒带,A系的电泳相同,B系的则不同,原因尚不清楚。用融合子的质粒DNA转化ki-2-132和C600都获得了转化体,其转化频率因实验条件不同而有差异。以上结果表明,大肠杜菌和枯草杄菌细胞之间能够相互融合,通过融合能从A、B两个方向转移质粒pTZ22,枯草杆菌的蛋白酶不阻碍细胞融合和质粒转移。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究 Ⅰ.多粘芽孢杆菌质粒的分离和鉴定

从多粘菌素E产生菌多粘芽孢杆菌中分离到两株药物抗性菌株,其中P19-4为双重抗生素抗性菌株(Ap~R、Sm~R),P250-2为多重抗生紊抗性菌株(Pen~R、Ap~R、Sm~R、Em~R、Tc~R、Nm~R、Cm~R、Km~R)。用吖啶橙消除质粒试验及亚硝基胍回复突变试验,初步证明抗生素抗性基因在质粒上,而决定多粘菌素E生物合成的基因可能在染色体上。用琼脂糖-溴化乙锭凝胶电泳分析在两株菌的DNA中鉴别出明显的质粒带,用电镜方法在两株菌的DN^制剂中均观察到共价闭合超螺旋和开放型环状两种构型的DNA分子。     

枯草杆菌α－淀粉酶基因的克隆和表达

以自构的质粒pBEl为载体,采用鸟枪法克隆枯草杆菌168突变株GRl0的α－淀粉酶基因,获得了在大肠杆菌中的表达。该基因片段位于7367bp的Bgl Ⅱ酶切片段上。利用质粒pUB110。将此片段亚克隆到枯草杆菌中,同样也获得了表达。本文还测定了该基因克隆子是否有GR10的抗葡萄糖阻遏效应。     

枯草杆菌启动子－信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗性基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢｏｍＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法测定了１０个克隆片段的ＤＮＡ顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β－内酰胺酶活力测定结果证明：大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。     

枯草芽孢杆菌bgls基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－1,3—1,4－葡聚糖酶基因(bgls)2．7kbEcoRl片段和酵母染色体Rdna片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列(Autonomusly replicating sequence)的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒YIP5上,构建成YIP5-bgls—Rdna的杂种质粒PCZH,转化S．Cerevisiae并得到表达。稳定性测定表明．Y 33(PCZH101)和Y 33(PCZH104)在无选择压力的YEPD培养基中繁殖70代以上,两个转化子90％以上的酵母细胞仍含有质粒并且遗传特征与染色体行为相似。以bgls基因作探针;与酵母染色体DNA的Southern bloot分子杂交证实bgls基因已整合到酵母菌染色体上。     

枯草杆菌中通过细胞融合的质粒转移

在PEG存在下,枯草杆菌BD366(pUB110)菌株和G1菌株的原生质体以10~(-6)—10~(-4)的融合率发生融合。在染色体的抗药性标记、营养要求和一般细菌学特征鉴定方面,多数融合子相似于亲本G1,所不同的是质粒上的抗药性标记相同于另一亲本菌株BD366,并且在高渗培养基上具有独特的菌落形态。融合子的以上一些特征极为稳定。高温能使质粒pUB110消除,质粒消除后融合子的菌落形态转变成为亲本G1的形态特征。我们认为双亲细胞融合后没有发生遗传重组,而是在分裂过程中发生分离,于是质粒pUB110可能出现在G1细胞中,因此本文为通过细胞融合的质粒转移和由于某一特定质粒的存在而改变菌落形态提供了初步证据。     

双功能质粒的构建与功能表达

将大肠杆菌抗四环素、氨基苄青霉素、氯霉素质粒pBR325和金黄色葡萄球菌/枯草杆菌抗新霉素、卡那霉素质粒pUB110,在体外经限制性内切酶EcoRI和T4 DNA连接酶作用,进行重组,获得了重组质粒pMM 1。pMM 1兼有抗四环素、氨基苄青霉素、卡那霉素和新霉素以及对氯霉素敏感的特性;用凝胶电泳法测定分子量,证明pMM1确为pBR325和pUB110两者的重组质粒。pMM 1在大肠杆菌中的转化频率为每微克DNA 0.79×10~3个转化子,在枯草杆菌受体中为每微克DNA 0.15×10~2个转化子。pMM1不仅能分别在大肠杆菌和枯草杆菌两种受体中复制,而且能同样表达,其抗药性水平为:对氨基苄青霉素不小于每毫升160微克,对四环素不小于每毫升120微克,对新霉素、卡那霉素不小于每毫升80微克。此外,用同样的方法构建了pBR 322和pUB 110的另一个重组质粒pMM 2,也获得了类似的结果。     

解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗生基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢａｎＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ     

地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶基因的分子克隆及其在枯草杆菌中的表达

以E.coli噬菌体λ EMBL 3为载体,用鸟枪法将地衣形芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶基因克隆到λ噬菌体的基因组中。携带α-淀粉酶基因的杂种噬菌体λ pAmy_αL16的DNA,经限制性内切酶HindⅢ水解后,被亚克隆到枯草杆菌的质粒pNQ 122上,并得到了表达。通过重转化作用和物理图谱分析,证明α-淀粉酶基因位于3.9 kb的Hin dⅢ DNA限制片段上。 转化子枯草杆菌(pAmy_αL41)产生的α-淀粉酶的热稳定性、最适反应温度等与亲本菌株一致。α-淀粉酶的分子量和等电点也与原菌株相同。     

地衣芽孢杆菌温和噬菌体的具有启动子功能片段的克隆

载体pTG402与地衣芽孢杆菌噬菌体B1p7经限制酶酶切并连接后转化大肠杆菌。从全部转化子中抽提质粒DNA,转化枯草杆菌后经苗落原位显色选到22个有启动子功能片段的克隆子。利用邻苯二酚双加氧酶对底物的显色反应,测定了15个克隆子的启动子活性,并绘制了启动子功能最强的重组质粒的酶切图谱。此外,还测定了两个克隆子在枯草杆菌各个生长期的表达情况,发现在对数生长后期表达量太增,认为识别这两个启动子的σ因子可能是σ³⁷。     

人源CD137L基因在不同表达系统中表达效率的比较

比较分析人源CD137L在毕赤酵母、枯草杆菌及大肠杆菌中的表达差异,建立适合CD137L的表达系统并检测CD137L的生物学活性。设计PCR引物,以酵母表达质粒pPIC9K-CD137L为模板,扩增CD137L片段,分别构建枯草杆菌表达质粒及大肠杆菌表达质粒,再转化至相应的宿主菌并筛选阳性转化子;SDS PAGE电泳分析CD137L的表达情况并比较差异;稀释复性法复性CD137L包涵体,用离子交换层析纯化CD137L;T细胞激活试验检测CD137L的活性。CD137L在3个表达系统中均可以表达并且得到质谱鉴定,但是在毕赤酵母、枯草杆菌中的表达量微弱,而在大肠杆菌中CD137L以包涵体形式高效表达,平均1 L培养液能得到0.8 g包涵体沉淀,200 mg变性蛋白。经复性纯化后得到的CD137L能有效激活T细胞增殖并且其刺激活性呈现浓度依赖效应。与毕赤酵母、枯草杆菌相比,大肠杆菌表达系统能高效表达CD137L蛋白,并且经稀释复性后CD137L保持了刺激小鼠T细胞增殖的活性。     

PTD-BDNF融合基因克隆、表达和纯化

构建含蛋白转导结构域(PTD)与脑源性神经营养因子(BDNF)融合基因的质粒,并在大肠肝菌中表达。用PCR扩增PTD-BDNF融合基因,经DNA测序无误后插入表达质粒pJW2构建质粒pJPB,转化大肠杆菌并进行PTD-BDNF蛋白的诱导表达和纯化。结果DNA序列分析表明构建含有PTD-BDTF融合基因的质粒与设计相同,PTD-BDNF融合蛋白在大肠杆菌中获得表达并进一步纯化。     

A亚群禽白血病病毒囊膜基因gp85片段在大肠杆菌中的表达

将RAV-1囊膜基因gp85片段亚克隆到表达质粒pET-21d(+)中得到重组表达质粒pET-21d-RAV-1env(BglII/SalI),序列分析表明该插入片段的核苷酸序列和阅读框都与RAV-1囊膜基因相应序列相同.用其转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明RAV-1囊膜基因融合蛋白表达产物约20kD,与理论值相符;IPTG诱导起始时间比诱导持续时间对表达量的影响更大.     

双功能质粒pCB33的构建及性质研究

枯草杆菌具有安全性好、产胞外蛋白、产品 中不含内毒素等优点。,14,201,是基因克隆的理想 受体,但也存在某些外源基因不能表达、用鸟枪 法克隆外源基因比较困难等缺点［113,16,181。若能 构建可在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达的 双功能质粒作为载体,以大肠杆菌为中间寄主, 利用其转化率高,克隆技术比较成熟的优点,先 将DNA片段克隆至大肠杆菌,经过鉴定后再 转至枯草杆菌中表达,则可克服枯草杆菌克隆 系统的以上缺点,有实际应用价值。目前,国外 已利用金黄色葡萄球菌质粒与大肠杆菌质粒重 组构建了一些双功能质粒115,1si,并已通过大肠 杆菌为中间宿主的方法将乙型肝炎病毒核心抗 原、口蹄疫病毒主要抗原117,及人干扰素。0i等基 因转人枯草杆菌中表达。本文描迷了作者之一 等分离的短小芽抱杆菌抗四环素质粒PC J 3121 和大肠杆菌质粒pBR 322分别用Bam HI和 Ava I双酶切,除去部分DNA片段后重组构 建双功能质粒pCB33的实验,并对其性质进行 了研究。     

剪接因子1N端1-320氨基酸片段的原核表达及纯化

目的:通过扩增剪接因子1(SF1)的N端1-320氨基酸(aa)片段对应的cDNA,构建His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),在大肠杆菌中诱导表达并进行亲和纯化。方法:PCR扩增SF1的1-320 aa片段对应的cDNA,扩增产物和载体pET-28a(+)经酶切回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆、酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和West-ern印迹分析蛋白表达情况,亲和纯化His-SF1(1-320aa)。结果:SF1片段以正确的读框插入pET-28a(+),IPTG可以诱导大肠杆菌表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western印迹证实得到相对分子质量约为40×103的蛋白,亲和纯化得到高纯度蛋白质。结论:构建了His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),并获得His-SF1(1-320aa)融合蛋白,为进一步研究SF1和U2AF65之间的相互作用及对剪接体形成的影响提供了基础。     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自于嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６染色体ＤＮＡ和双元载体ｐＢＩ１２１组成,且农杆菌ＬＢＡ４４０４转化子含有来自大肠杆菌亚克隆转化子的ｐＬＧＣ质粒。     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的 …

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自     

西方许旺酵母α-淀粉酶的基因克隆及其在啤酒酵母中的高效表达与分泌

以E .coli/yeast穿梭质粒YCEp1为载体构建许旺酵母部分基因组文库 ,在大肠杆菌中扩增后提取混合质粒DNA ,经电转化非缺陷标志啤酒酵母AS .2 1 36 4 ,在YPDS平板 ( 1 %葡萄糖和 1 %可溶性淀粉 )上用淀粉水解活力筛选含水解淀粉能力的阳性转化子 .从阳性转化子中分离融合质粒证实含 5 0kb的插入片段 .用α 淀粉酶基因两端序列设计的引物PCR扩增及扩增片段序列分析证实该片段中含有α 淀粉酶全部编码序列 .该片段能在啤酒酵母中表达α 淀粉酶 ,说明该片段带有α 淀粉酶基因 5′ 上游序列和 3′ 下游序列 .该转化子在YPDS平板 30℃培养 48h形成清晰可见的水解淀粉圈 .发酵液 (YPDS) 48℃可获得 740～ 780mU/mL产酶活力和高的生物量 .PAGE证实发酵液有α 淀粉酶蛋白带 ,占胞外总蛋白含量的 1 2 %以上 .说明在载体YCEp1上许旺酵母α 淀粉酶基因自身启动子 ( promoter)和终止子(terminator)在啤酒酵母AS .2 .1 36 4中同样被识别且高效表达 .有工业应用前景的水解淀粉酵母菌株构建成功 .