鸡Apo-AI基因g.-163 A>T单核苷酸多态性的功能性分析

鸡Apo-AI基因g.-163 A>T单核苷酸多态性(SNP)与鸡腹脂重和腹脂率显著相关. 生物信息分析显示,该SNP位于鸡Apo AI基因转录起始位点,提示它可能是一个功能性SNP. 为确定该SNP的功能性, 本研究分别构建了含该SNP位点A和T等位基因的启动子报告基因载体,分别在DF1细胞和HepG2细胞中比较这2个等位基因对鸡Apo AI基因启动子活性的影响. 研究发现,T等位基因的启动子报告基因活性及报告基因mRNA表达水平均显著高于A等位基因（P<0.05）,表明该SNP影响基因表达,是1个功能性SNP. 本研究结果提示,鸡Apo-AI基因g.-163 A>T有望作为优质鸡育种的功能性分子标记.     

鸡miR-17-92基因簇靶基因ZFPM2的鉴定及功能分析

miR-17-92基因簇在哺乳动物的许多生理和病理过程中发挥重要作用。本实验室前期研究发现,miR-17-92基因簇促进鸡前脂肪细胞的增殖,但其作用机制尚不清楚。为了揭示miR-17-92基因簇促进鸡前脂肪细胞增殖的作用机制,本研究采用CCK-8细胞增殖检测方法分析干扰ZFPM2对前脂肪细胞的影响,结果发现,干扰ZFPM2能显著促进鸡前脂肪细胞的增殖(P<0.01);与CCK-8分析结果相一致,干扰ZFPM2可致使细胞增殖标志基因PCNA、Ki67、Cyclin D1的mRNA表达量明显升高(P<0.01或P<0.05)。进一步对鸡ZFPM2基因进行生物信息学分析,发现该基因mRNA的3′UTR有两个区域存在miR-17-92基因簇4个成员(miR-17-5p、miR-20a、miR-19a及miR-19b)的潜在结合位点。为验证miR-17-92基因簇是否靶作用于鸡ZFPM2基因,构建了鸡ZFPM2基因3′UTR区的荧光素酶报告基因载体(野生型)(psi-CHECK2-ZFPM2-3′UTR-WT)及其突变型的荧光素酶报告基因载体(psi-CHECK2-ZFPM2-3′UTR-MUT)。报告基因活性分析显示,过表达mi-17-92基因簇能极显著地抑制野生型ZFPM2的报告基因活性(P<0.01);转染miR-17-5p、miR-20a及miR-19a的抑制剂均能显著地提高野生型ZFPM2报告基因的活性(P<0.01或 P<0.05),但这些抑制剂对突变型ZFPM2报告基因的活性无明显影响。qRT-PCR分析发现,miR-17-5p、miR-19a及miR-20a的抑制剂能显著提高内源性ZFPM2基因mRNA的表达水平(P<0.01或P<0.05)。共转染分析发现,尽管差异不显著,但miR-17-5p和miR-19a的抑制剂均倾向于降低ZFPM2干扰片段的促细胞增殖作用。本研究结果表明：miR-17-92基因簇成员miR-17-5p、miR-20a、miR-19a及miR-19b靶作用于ZFPM2;miR-17-92基因簇至少部分通过抑制ZFPM2基因表达从而促进鸡前脂肪细胞的增殖。     

鸡PPARγ基因转录本3上游开放阅读框转录后的调控作用

过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是脂肪生成的关键调控因子。本实验室前期研究发现,与人和鼠等哺乳动物PPARγ基因的转录本不同,鸡PPARγ基因的多个转录本5′UTR区存在上游开放阅读框(upstream open reading frames, uORFs)。为了揭示该uORF转录后的调控作用,本研究构建了鸡PPARγ基因转录本3 (cPPARγ3)野生型5′UTR报告基因载体psiCHECK2-cPPARγ3- 5′UTR-WT和uORF突变(uATG突变为终止密码子TGA)的5′UTR报告基因载体psiCHECK2-cPPARγ3- 5′UTR-Mut。将这两个报告基因载体分别转染永生化鸡前脂肪细胞(immortalized chicken pre-adipocytes, ICPA)和鸡胚成纤维细胞DF1,检测海肾荧光素酶报告基因hRluc活性及其mRNA表达。荧光素酶报告基因检测结果显示,在ICPA细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut的hRluc报告基因活性极显著高于psiCHECK2- cPPARγ3-5′UTR-WT (P<0.01);在DF1细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut的hRluc报告基因活性高于psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-WT,但差异不显著(P>0.05)。qRT-PCR检测hRluc基因mRNA表达结果显示,与psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-WT相比,在ICPA细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞的hRluc基因的mRNA表达水平极显著降低(P<0.01);在DF1细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞后,hRluc基因的mRNA表达水平也降低,但差异不显著(P>0.05)。为进一步分析该uORF对鸡cPPARγ3的转录后调控作用,本研究又分别构建了野生型cPPARγ3真核表达载体pcDNA3.1-cPPARγ3-WT和uORF突变的cPPARγ3真核表达载体pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut。qRT-PCR检测cPPARγ3的mRNA表达水平,结果显示,在这两种细胞中,pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut转染细胞的cPPARγ3 mRNA表达水平均显著低于pcDNA3.1-cPPARγ3-WT转染细胞(P<0.05),但Western blot结果显示,pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut转染细胞的PPARγ蛋白表达水平极显著高于pcDNA3.1-cPPARγ3-WT转染细胞(P<0.01)。这些研究结果表明,5′UTR区的uORF抑制鸡cPPARγ3的翻译。     

鸡6个功能基因microRNA靶标区域SNP的生物信息学预测

GDF-8、IGF-I、IGF-III、IGF2R、IGFBP2和GHR是鸡的重要经济性状候选基因。利用miRanda和Targetscan软件预测6个基因3′UTR潜在的microRNA靶标, 并发掘靶标区域SNP位点。结果表明: 在6个基因的26个microRNA靶标区域, 共检测到125个SNP位点, 在靶标及其5′和3′邻接等长侧翼区分别检测到47个、44个和35个SNPs位点, 其中12个SNP定位于靶标种子序列互补区。种子序列互补区及其3′侧翼区的SNP位点可能会影响microRNA的调控, 导致家禽的表型变异     

大鼠Cacnb1报告基因载体构建及miR-16靶向验证

子宫平滑肌过度收缩可导致原发性痛经。钙通道在子宫平滑肌收缩过程中起关键作用,钙通道电压依赖性β1蛋白(voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-1,CACNB1)是其主要组成部分。为探讨mi R-16在子宫平滑肌细胞收缩过程中的调控功能,需验证大鼠Cacnb1基因是否为mi R-16的靶基因。首先,设计特异性引物,扩增大鼠Cacnb1基因3′UTR序列,将扩增片段克隆到pmi R-RB-REPORTTM双荧光素酶报告基因载体,同时构建大鼠Cacnb1基因3′UTR突变的载体;随后,包含正常Cacnb1基因3′UTR序列的载体和突变后的载体分别与mi R-16 mimics共转染293T细胞,检测相对荧光素酶活性变化。结果发现,mi R-16 mimics能够通过结合大鼠Cacnb1基因3′UTR序列显著抑制荧光素酶活性(n=3,P0.001),而对大鼠Cacnb1基因3′UTR突变后的荧光素酶活性无抑制作用。因此,mi R-16能够负向调控大鼠Cacnb1基因的表达,故大鼠Cacnb1基因是mi R-16的靶基因。     

更正

<正>于莹莹,等.鸡IGFBP2基因3′UTR区1196CA单核苷酸多态性的功能性鉴定及分析.生物化学与生物物理进展,2014,41(11):1163-1172因编辑部工作失误造成上述论文图3的部分内容在印刷版中缺失,现将正确的图3刊登如下,并就此向作者及广大读者致歉!     

PLOD3基因3′调控区的人类特异突变改变miR-124a对PLOD3的调控

microRNAs(miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的不编码蛋白质的小RNA(长度20—24个碱基)。其中,miR-124a是一个在哺乳动物中枢神经系统高度表达的miRNA,在神经前体细胞向神经元分化的过程中起着举足轻重的作用。由于miRNAs特异性地识别靶基因的3′端调控区(3′UTR)的靶序列,因此,在人类起源过程中基因3′UTR的单核苷酸序列变异有可能导致miRNA调控的改变。通过靶基因预测和3′UTR区在哺乳动物代表物种间的同源序列比较,我们发现miR-124a的靶基因中有一个基因(PLOD3)3′UTR的靶位点中存在人类特异突变位点。利用体外报告基因系统,发现PLOD3基因3′UTR靶位点中所含的一个人类特异的突变导致miR-124a对PLOD3的调控效率降低。研究表明,miRNAs靶基因3′UTR的序列变异具有功能效应,它有可能是人类中枢神经系统在起源和演化中发挥关键作用的重要遗传机制之一。     

miR-181a调控骨髓间充质干细胞中OPG水平及对破骨细胞活性的影响

该研究预测并验证骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)中mi R-181a对靶分子骨保护素(osteoprotegerin,OPG)m RNA水平的调控作用,探讨其在骨质疏松发病过程中对破骨细胞活性的影响。通过生物信息学预测mi R-181a可能调控的靶基因OPG,构建含mi R-181a结合位点的OPG m RNA 3′UTR(3′untranslated regions)荧光素酶报告载体。通过双荧光素酶载体系统检测mi R-181a与OPG m RNA 3′UTR相互作用对荧光素酶活性的影响;转染mi R-181a进入BMMSCs并与破骨细胞共培养,TRAP(tartrate resistant acid phosphatase)染色检测共培养体系中破骨细胞数目的改变。结果表明,双荧光素酶报告提示,mi R-181a的靶分子为OPG m RNA,上调mi R-181a(mimics组)水平后,破骨细胞数目较对照组显著增多(P0.05);下调mi R-181a(inhibitor组)水平后,破骨细胞数目较对照组显著降低(P0.05)。研究结果显示,mi R-181a可以负调控OPG的蛋白水平,进而影响破骨细胞活性。     

miR-181b-5p调控TIMP3对apoE~(-/-)鼠动脉粥样硬化炎症影响及相关因子检验

为探究mi R-181b-5p靶向调控TIMP3对apo E~(-/-)鼠动脉粥样硬化炎症的影响,本研究基于生物信息学预测筛选,并采用双荧光素酶报告基因系统验证mi R-181b-5p靶基因。同时在ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞及apo E~(-/-)动脉粥样硬化模型小鼠中检测mi R-181b-5p靶基因m RNA及蛋白水平的表达情况,并且检测转染mi R-181b-5p后细胞水平和动物体内炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18、CCL2的表达变化。此外,通过病理切片方法检测转染mi R-181b-5p后小鼠主动脉窦处病变情况。研究通过双荧光素酶报告基因系统验证TIMP3为mi R-181b-5p靶基因,并在ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞及apo E~(-/-)动脉粥样硬化模型小鼠中证明了mi R-181b-5p可以降低TIMP3转录水平从而降低其蛋白水平表达,同时研究发现mi R-181b-5p在细胞水平和动物体内均会增强炎症因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-18、CCL2的表达,并可以增加小鼠主动脉窦处病变面积。研究认为在动脉粥样硬化发生中,mi R-181b-5p可以增加病变面积并且提升相关炎症因子的表达、分泌,其作用机理很可能是通过抑制靶基因TIMP3表达,进而降低TIMP3蛋白水平实现的,为研究动脉粥样硬化机制提供了理论依据。     

过表达鸡Gata2或Gata3基因抑制Pparγ基因的转录

脂肪细胞分化是脂肪组织发育的一个重要过程. 目前,鸡脂肪细胞分化的分子调控机制还不十分清楚. 哺乳动物的研究结果表明,转录因子GATA结合蛋白2(Gata2)和GATA结合蛋白3(Gata3)具有抑制脂肪细胞分化的功能,它们在白色脂肪组织和棕色脂肪组织中的表达模式不同. 鸡没有棕色脂肪组织,目前还没有关于Gata2 和Gata3作用于鸡脂肪细胞分化的研究报道. 本研究利用半定量RT PCR的方法分析了Gata2和Gata3基因在鸡腹部脂肪组织和前脂肪细胞中的表达规律,发现鸡腹部脂肪组织中高水平表达Gata2 基因,低水平表达Gata3基因|鸡前脂肪细胞中Gata2 基因的表达水平远高于Gata3基因的表达水平,油酸诱导分化后的鸡前脂肪细胞Gata2基因的表达水平明显下调.此外,鸡过氧化物酶体增殖体激活受体γ(Pparγ)启动子（－1985/－89）报告基因荧光素活性分析和半定量RT PCP发现,在DF1细胞中过表达Gata2 或Gata3抑制鸡PPARγ基因的转录. 本研究结果为进一步研究鸡脂肪细胞分化的分子调控机制和Gata2和Gata3基因的生物学功能提供了参考.     

miR-138转录可下调p33ING1在衰老细胞中的表达

p33ING1参与了多种生物学过程,包括细胞生长抑制、凋亡、DNA损伤修复、染色质重塑等．近来研究显示,p33在细胞衰老过程中表达降低,这可能与衰老细胞的抗凋亡有关．但p33在衰老细胞中表达下调的分子机理仍不清楚．我们发现,在衰老细胞中miR-138表达升高与p33基因的表达降低密切相关．以下实验结果支持如此结论：(1)与年轻细胞相比,带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性在衰老细胞中降低;突变3′UTR上的miR-138结合位点可升高报告载体荧光素酶在衰老细胞中的活性;(2)在衰老细胞中miR-138的表达升高;(3)在年轻细胞中,过表达miR-138不仅可抑制带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性,而且下调细胞内p33ING1基因mRNA和蛋白水平.与此相反,抑制miR-138活性可升高带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性,并且上调细胞内p33ING1基因mRNA和蛋白水平．这些结果表明,p33ING1基因是miR-138的靶基因;在衰老过程中,miR-138表达升高, 由此导致该基因的表达降低．     

SOX6 基因3'UTR 区野生型和突变型重组质粒的构建与鉴定

目的:构建含单核苷酸多态性(SNP)位点rs1065024的SOX6基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体,并用生物信息学软件预测与rs1065024位点区域相结合的mi RNA,为进一步研究此SNP位点的功能及mi RNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系奠定基础。方法:提取人全血基因组DNA,以基因组DNA为模板,通过PCR扩增含SNP位点在内的SOX6基因3'UTR片段,经过胶回收纯化后,将回收的目的片段插入双荧光素酶报告基因载体p MIR-REPORT中,再经DH5a转化扩增,挑单克隆进行菌落PCR并进行质粒提取,对质粒进行双酶切鉴定,最后进行DNA测序鉴定。针对SNP进行定点突变,构建出野生型和突变型重组质粒,并用生物信息学软件预测出与SNP位点相结合的mi RNA。结果:经单菌落质粒测序验证显示带有T碱基的SOX6基因3'UTR重组质粒p MIR-REPORT-3'UTR-T构建成功;经定点突变,成功将p MIR-REPORT-3'UTR-T质粒转变为p MIR-REPORT-3'UTR-C,经比对未引入任何其他突变;生物信息学预测显示,rs1065024位点位于mi R-190b、mi R-190a-5p、mi R-451b、mi R-4791与SOX6基因3'UTR的结合区域,其多态的改变可以影响mi RNA与m RNA的结合效率。结论:本研究成功构建了含SNP位点rs1065024的p MIR-REPORT-SOX6-3'UTR野生型和突变型重组质粒,为今后SOX6基因3'UTR的SNP位点的功能及mi RNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系研究奠定基础。     

miR-483-3p靶向CD44抑制EGFR突变肺癌的作用研究

目的:探讨mi R-483-3p对CD44表达的调控作用及采用脂质体载药系统递送mi R-483-3p治疗表皮生长因子(epidermalgrowth factor receptor,EGFR)突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的作用。方法:通过mi R-483-3p靶基因的数据库发现CD44可能是mi R-483-3p的靶基因之一,从结构上及功能上进行验证。在EGFR酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)耐药的NSCLC模型中,分别从基因及蛋白水平检测耐药模型及敏感模型中CD44的表达。在HCC827GR移植瘤模型中,采用脂质体-鱼精蛋白-DNA (liposome-polycation-DNA, LPD)载药系统递送mi R-483-3p进行治疗,观察肿瘤的生长情况。结果:双荧光素酶报告基因实验及Western blot实验结果显示CD44是mi R-483-3p的靶基因之一,且CD44在EGFR-TKI耐药模型中异常高表达(P0.05)。脂质体载药系统LPD-mi RNA-DSPE-PEG符合静脉给药要求,Size为66.93±21 nm,Zeta potential为8.7±2 m V,PDI (Polydispersity Index)为0.1,递送mi R-483-3p后能够抑制HCC827GR移植瘤的生长(P0.05)。结论:CD44为mi R-483-3p的靶基因之一,在耐药模型中高表达,脂质体载药系统给予mi R-483-3p能够抑制EGFR-TKI耐药肿瘤的生长。     

MiR-324-5p可能通过靶向淀粉样前体蛋白抑制棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡

miRNAs是一种非编码的小RNA,通过靶向mRNA的3′UTR调控基因的转录后翻译。为明确miR-324-5p对棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡的作用和机制,体外培养3T3-L1脂肪细胞,利用棕榈酸诱导细胞凋亡的同时过表达或抑制miR-324-5p,通过Annexin-V/FITC染色、RT-qPCR等方法检测miR-324-5p对3T3-L1脂肪细胞凋亡的作用。通过在线软件预测miR-324-5p的靶基因并进行验证。结果显示,过表达miR-324-5p能够显著抑制凋亡相关基因BCL-2相关X蛋白(BCL2-associated X protein, Bax)和胱天蛋白酶3(caspase3)的表达水平(P0.05);而抑制miR-324-5p后能够显著促进这些基因的表达(P0.05);靶基因预测及验证结果表明,miR-324-5p能够显著降低淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的表达水平(P0.05)。本研究认为,miR-324-5p可能通过靶定APP抑制棕榈酸诱导的3T3-L1脂肪细胞凋亡。     

坝上长尾鸡pmel基因核心启动子的鉴定

为探明坝上长尾鸡的前黑素小体蛋白(Pre-melanosomal protein,Pmel)基因核心启动子区,首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1,并利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动活性检测。成功克隆了坝上长尾鸡pmel基因5?侧翼区片段1268bp,预测启动子区(-1200–+68)含有2个CpG岛和多种转录因子结合位点,构建了9个含有不同长度pmel基因启动子片段的表达载体及1个核心启动子区突变载体,说明鸡pmel基因启动子的核心区域为-840–+68bp,其中-840–-590bp和-525–-266bp区域为正调控区,-590–-525bp区域为负调控区,多态位点(-456、-435、-410、-374和-341)对pmel基因启动子活性有较大影响。     

热休克蛋白gp96 3′UTR作为ceRNA通过 miR-642a调控DOHH的表达

热休克蛋白gp96在肝脏等多种肿瘤中过量表达,与肿瘤的恶性程度和患者不良预后呈显著相关性,其在肿瘤发生发展中作用机制有待深入探讨.通过生物信息学技术预测、荧光素酶报告基因检测、免疫印迹分析、实时定量PCR、RNA干扰,研究gp96 3′UTR作为ceRNA(competing endogenous RNA)对miR-642a和脱氧羟腐氨酸羟化酶(deoxyhypusine hydroxylase,DOHH)表达的影响.研究结果显示,miR-642a特异性靶向的野生型gp96 3′UTR,而不是miR-642a结合位点突变的gp96 3′UTR,可吸附下调miR-642a并同时上调miR-642a靶基因DOHH的表达,进一步研究发现gp96 3′UTR对DOHH的调控依赖于miR-642a.实验还发现DOHH并不影响gp96的表达.Gp96通过ceRNA上调DOHH的表达,为研究gp96促进肝癌等肿瘤的发生发展提供了新思路.     

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3’UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3’UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3’UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3’UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3’UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。     

HBx抑制IGFBP3转录的机制

【目的】在细胞水平上研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)转录的影响并对具体机制进行初步探索。【方法】首先采用RNA-Deep-Sequencing技术分析HepG2和乙型肝炎病毒(HBV)转基因细胞HepG2-4D14中表达差异的基因,然后通过实时定量PCR对相关基因进行验证;利用启动子报告基因分析,研究HBx对相关基因IGFBP3转录的调控;通过染色质免疫共沉淀方法,分析HBx抑制IGFBP3启动子活性的机制。【结果】RNA-Deep-Sequencing的结果表明IGFBP3在HBV转基因细胞HepG2-4D14中水平显著下调,实时定量PCR结果与RNA-Deep-Sequencing一致。进一步研究表明HBx能明显抑制IGFBP3的转录,通过实时定量PCR发现HBx对IGFBP3转录的抑制作用依赖于p53;染色质免疫共沉淀实验结果表明HBx能够通过抑制p53与IGFBP3启动子的结合,从而抑制IGFBP3的转录。IGFBP3是一种细胞周期负调控蛋白,我们推测HBx对IGFBP3水平的下调是其促进细胞增殖的途径之一。【结论】HBV能显著下调IGFBP3的转录,机制研究揭示HBV HBx通过干扰p53与IGFBP3启动子的结合进而抑制IGFBP3的转录。     

鸡gga-miR-7b靶基因VDAC1-3’UTR双荧光素酶报告基因质粒的构建

本研究以鸡gga-miR-7b作为研究对象,为了明确与肿瘤形成相关的关键基因VDAC1(Voltage-dependent anion channel 1)是否为gga-miR-7b的靶基因,深入研究gga-miR-7b对VDAC1基因的调控作用,本研究运用TargetScan和miRBD生物学软件预测了gga-miR-7b与VDAC1 m RNA的3’端非编码区(3’UTR)存在种子结合位点(GTCTTCC),并使用PCR克隆以及同源重组突变的方法构建VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒,经SacⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定及测序结果显示,片段大小符合且序列正确;成功构建了VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒并命名为pmirGLOVDAC1-wt3’UTR和pmirGLO-VDAC1-mut3’UTR。本研究结果进一步为gga-miR-7b候选靶基因VDAC1的鉴定以及功能研究提供理论依据。     

子宫肌瘤差异表达microRNA的定量分析及靶基因鉴定

Micro RNA(mi RNA)是一类非编码单链小分子RNA,广泛参与人类各种生理、病理过程。最新研究提示,mi RNA在子宫肌瘤中起着重要调控作用,该研究试图对子宫肌瘤组织中差异表达mi RNAs进行表达验证及靶基因鉴定,结果发现,与瘤旁组织相比,mi R-363、mi R-490、mi R-135b等的表达水平在肌瘤组织中有着4~6倍的上调,而mi R-217、mi R-590、mi R-451则下调3~5倍。通过软件预测结合表达定量分析,发现其中mi R-363的靶基因为卵泡激素相互作用蛋白1基因(folliculin interacting protein 1,FNIP1)和溶质载体家族蛋白12成员5(solute carrier family 12 member5,SLC12A5)。mi R-135b的靶基因核受体亚科3 C组,成员2(nuclear receptor subfamily 3,group C,member 2,NR3C2)在肌瘤组织中表达有显著下降,而mi R-590的靶基因锌指蛋白367基因(zinc fi nger protein 367,ZFN367)和去泛素水解酶1基因(yeast OTU deubiquinating enzyme 1 homolog,YOD1)在肌瘤组织中的表达水平显著上升。进一步的报告基因分析发现,其中FNIP1、NR3C2、ZNF367的3′UTR能够与相应的mi RNA结合。分析相同肌瘤样品中表达水平的关系发现,这三个靶基因表达均与相应的mi RNA呈显著的负相关。该研究的发现为子宫肌瘤的分子机制研究和诊治提供了新的参考。