丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展

丝状真菌,俗称霉菌,在食品工业中被用于生产多种生物酶和有机酸。近年来,人们发现丝状真菌具有分泌量大、表达的蛋白有天然活性等特点,非常适合作为同源和异源重组蛋白的表达宿主,因此被广泛研究和探讨。简要综述了以黑曲霉为代表的几种常被用作蛋白表达宿主的丝状真菌的特点、应用中的主要问题和基本解决方案,以及近年关于丝状真菌表达系统的最佳培养条件和发酵条件的研究进展。     

黑曲霉N-2植酸酶phy4基因的克隆及其重组酵母表达载体的构建

根据已发表的植酸酶phyA基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以黑曲霉N-2总DNA为模板,扩增出不包含假定信号肽序列的phyA基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为1350bp,与已发表的黑曲霉NRRL3135的phyA基因的同源性为92．4％(不计内含子),编码1个含449个氨基酸残基的蛋白质,推导的氨基酸序列同源性为95．1％。将该基因与分泌型载体pPIC9K连接,构建了植酸酶基因的重组酵母表达载体pPIC9K／phyA。     

丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展

丝状真菌是具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统, 能对蛋白质进行翻译后修饰, 如蛋白质糖基化等; 并且比植物、昆虫和哺乳动物细胞具有更快的生长速率。近年来, 随着真菌分子遗传技术和菌种改良策略的进步, 尤其是真菌基因组学的发展, 利用丝状真菌生产异源蛋白越来越受到关注。综述了丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的最新探索与进展, 其中包括功能基因组学在蛋白表达与分泌研究中的应用, 同时探讨了异源蛋白表达和生产的改进策略。     

丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展

丝状真菌是具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统, 能对蛋白质进行翻译后修饰, 如蛋白质糖基化等; 并且比植物、昆虫和哺乳动物细胞具有更快的生长速率。近年来, 随着真菌分子遗传技术和菌种改良策略的进步, 尤其是真菌基因组学的发展, 利用丝状真菌生产异源蛋白越来越受到关注。综述了丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的最新探索与进展, 其中包括功能基因组学在蛋白表达与分泌研究中的应用, 同时探讨了异源蛋白表达和生产的改进策略。     

MAGE-3原核表达载体的构建和表达

通过RT-PCR扩增957bp的MAGE-3全长编码序列,将该片段克隆至Pgex-4T-2原核表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达,并经12%SDSPAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定,证明了目的基因的有效表达,目的蛋白高达细菌总蛋白的32%。表达产物经Glutathione Sepharose 4B 纯化后,每100mL菌液最终可获得3mg的目的蛋白,蛋白纯度在90%以上。纯化的GST-MAGE-3蛋白在体外冲击树突状细胞,能诱导特异性CTL杀伤肿瘤细胞活性。     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

瑞氏木霉外源基因表达系统中受体菌株的改造

将解除了葡萄糖阻遏的纤维素酶高产菌株瑞氏木霉TrichodermareeseiRutC30经EMS诱变后,在酪蛋白平板上筛选出部分蛋白酶缺陷突变菌株T.reeseiRutC30M3。RutC30M3的胞外蛋白酶活力比亲本株降低约74%,但生长特性、产纤维素酶活力等性状与亲本株相同。用携带潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的表达质粒pAN7-1分别转化瑞氏木霉RutC30和RutC30M3原生质体,转化结果显示RutC30M3(pAN7-1)对潮霉素的抗性比RutC30(pAN7-1)提高约20%,而Northernblot分析结果显示在两菌株中潮霉素基因转录水平相似,由此证明宿主菌蛋白酶缺陷对保护重组蛋白免于降解有明显作用。蛋白酶缺陷菌株RutC30M3适于作为瑞氏木霉外源基因表达系统中的受体菌株用于大量生产同源与异源蛋白。     

酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS21416中分离纯化出总RNA和mRNA,以AMV逆转录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有1507个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达99.6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

用于丝状真菌的苯菌灵标记基因benA表达载体的构建

为了构建适用于丝状真菌遗传转化的表达载体,在质粒pAN52-1的高效组成型三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和色氨酸C基因终止子TtrpC之间加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ两个位点,构成质粒pAN52-2;把质粒pAN52-2中从启动子PgpdA到终止子TtrpC的基因片段通过PstⅠ和XbaⅠ酶切位点导入到pUC19载体上,并且应用PCR的方法在启动子Pg-pdA的前端引入HindⅢ酶切位点,构成质粒pUCPT-2;通过PCR,在苯菌灵抗性基因benA两端分别加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ酶切位点,并克隆到pGEM-T载体上,得到质粒pGEM-Ben;用NotⅠ分别酶切质粒pUCPT-2与pGEM-Ben,连接苯菌灵抗性基因benA到pUCPT-2上,得到了pUCPT-Ben载体。经PCR、酶切和核苷酸序列检测,证实了PgpdA-benA-TtrpC表达元件连接成功,即得到了苯菌灵抗性基因高效表达载体。     

枯草芽胞杆菌蛋白质表达分泌系统发展及展望

枯草芽胞杆菌作为革兰阳性模式菌株是基础研究和工业应用的常用宿主细胞。介绍了枯草芽胞杆菌中蛋白合成和分泌过程中的重要步骤及重要调控位点。在枯草芽胞杆菌蛋白表达及分泌系统中,可以针对目标基因在体内的转录、翻译、折叠、转运和菌株改造等方面对表达分泌系统进行优化改良,针对不同的目标蛋白,可进行不同优化模块的组装和拼搭,以达到针对目标蛋白产物定制化地提高产量和分泌量的目的。在未来,随着基因编辑和合成生物技术的发展,菌株改良策略的不断优化,枯草芽胞杆菌将会在工业生产蛋白质制品领域发挥更大的应用价值。     

具有细胞毒活性红树林真菌094811的鉴定

为鉴定合成细胞毒活性及多羟基甾醇脂肪酸酯新结构代谢产物的红树林真菌094811,采用形态观察、BIOLOG生理特征鉴定及核糖体18S rDNA测序对菌株094811进行了鉴定。菌株094811与模式菌株黑曲霉As3.40、泡盛曲霉As3.44形态特征极为相似,难以区分。扫描电镜下分别观察且比较菌株094811、模式菌株黑曲霉As3.40、泡盛曲霉As3.44分生孢子的形态,判断菌株094811为泡盛曲霉;根据BIOLOG微生物鉴定系统给出的相似菌种名称及综合形态和生理生化特征,推断菌株094811为泡盛曲霉;通过18S rDNA部分序列测序、GenBank比对,及系统演化分析进一步确认菌株094811为泡盛曲霉。菌株094811的形态、生理特征及其核糖体18S rDNA的序列特征给出了一致的结论。首次鉴定发现1株具有合成细胞毒活性及新的多羟基甾醇脂肪酸酯结构化合物的能力的泡盛曲霉。     

促进真菌染色体重组的MCB^L共诱导平板的构建和应用

基于对樟脑（Ｃａｍｐｈｏｒ）和苯菌灵（Ｂｅｎｏｍｙｌ）可能分别诱导细胞核膜融合和染色体不分离性重组的机理认识,设计了ＭＣＢＬ共诱导平板,以察氏（Ｃｚａｐｅｋ）培养基含有１％Ｃａｍｐｈｏｒ及０５μｇ／ｍｌＢｅｎｏｍｙｌ为基础制作平板。以属间融合组合Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ×Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｓｅｉ为例,研究所设计的几种诱导平板处理方法对融合子代群体的基因型和表型变异的影响,结果表明常规分步诱导处理,杂合二倍体阶段缺乏或极短暂难以获得重组单倍体;而经过ＭＣＢＬ共诱导平板处理能够获得类型齐全的分离子,显著提高表观二倍化率和染色体不分离性重组单倍体的比率。显示ＭＣＢＬ共诱导平板能够有效地扩增捕捉到极短暂杂合二倍体的机率,促进不稳定异核体向重组单倍体的转化,扩增染色体不分离性重组频率。再生菌丝菌龄对共诱导效果影响显著。由此对共诱导机制和应用前景提出讨论。     

Fungi associated with black tea and tea quality in the Sultanate of Oman

Forty-eight samples of four popular commercial brands of black tea ( Camellia sinensis L.) were purchased from the local markets in Muscat area, Sultanate of Oman. Tea leaves were surveyed for mycoflora. Five fungal species were isolated with A. niger as the most dominant in all the brands having percentage contamination ranging between 0.66% and 30.34%. Other fungi isolated were Aspergillus flavus, Penicillium spp. and Pacelomyces spp. but having average percentages of 0.6%, 0.84% and 0.21% respectively. Significant differences were found among the batches contaminated by A. niger. None of the 25 A. flavus strains screened for aflatoxins were found aflatoxigenic. The total ash, water-soluble ash, and mineral concentration of the samples were within the British standards and were not affected by fungal contamination. The results showed that black tea is contaminated by fungi that might constitute health hazards for humans. The post harvest contamination of tea could be eliminated or reduced if processing is conducted under more hygienic conditions. This revised version was published online in June 2006 with corrections to the Cover Date.     

糖化酶生产菌株种子制备工艺优化

目的：缩短糖化酶工业生产菌株黑曲霉A.nigerCICIM GB0506的种子制备周期。方法：对该菌的活化培养基配方及种子制备方式进行改良,并通过L9（3^4）正交试验对其液体培养方法进行优化。结果：在固体活化培养基中添加0.2%的酵母粉及1%的玉米淀粉,有利于加速菌体生长;加入40粒,粒径3-4mm的玻璃珠130r/min,摇床培养可以获得更为分散、均一的种子液;液体种子制备的较优条件为初始pH4.5,装液量90mL,琼脂加量0.1%,培养天数5d。结论：新的制备工艺使糖化酶种子制备时间较现在工业生产上使用的工艺缩短了4d,进行后续糖化酶摇瓶发酵产酶水平是原工艺的1.18倍。     

黑曲霉W25菌株纤维素酶合成调控问题初探

研究了各种氮、碳源对黑曲霉Ｗ２５菌株生长和产酶的影响,黑曲霉纤维素酶的形成同时受诱导和阻遏系统的调节,这是微生物细胞经济而有效地合成酶的一种调节方式。     

产植酸酶菌株的分离筛选研究

研究了产植酸酶菌株分离筛选的方法 ,筛选得到分别适宜液态发酵和固态发酵的酶活力较高的黑曲霉XH和黑曲霉PA两菌株。在液态发酵KH2 PO4 对植酸酶产生有促进作用 ,其最佳用量为 8mg %;在固态发酵KH2 PO4 的添加对植酸酶的产生无明显促进作用。 2菌株所产植酸酶具有相似的酶学性质 ,最适作用温度为 5 5℃ ,当底物 pH为 3～ 5具有较高的酶活力。     

丝状真菌蛋白表达系统研究进展*

丝状真菌以其优秀的表达分泌能力和良好的环境适应能力,使得其在蛋白质表达领域应用越来越广泛。近几十年来,通过诱变、培养优化及遗传改造等手段,使得包含曲霉属、木霉属、青霉属等在内的丝状真菌被开发成高效表达宿主。为促进丝状真菌蛋白表达系统的开发,结合作者的研究工作,对工业上丝状真菌表达宿主、蛋白质表达元件及其改造策略进行综述,并探讨了当前丝状真菌表达系统开发过程中的不足之处,为新型丝状真菌表达系统的研究提供参考和启示。     

植酸酶产生菌黑曲霉N14的诱变选育及其基因分析

以植酸酶产生菌黑曲霉03214为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,获得了产酶活性较出发菌株提高了22．3％,达422IU／ml发酵液的突变菌株黑曲霉N14,其最适pH值为2．5,最适温度为50℃。通过对黑曲霉N14植酸酶phyA基因进行PCR扩增,获得了一条长约1．5kb的特异性产物。以pMD18-T为载体,构建了含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列测定表明,目的基因片段含有植酸酶phyA基因的完整序列(GenBank Accession：AY426977),phyA基因全长1506bp,其中包含一段长102bp的内含子,编码467个氨基酸,有10个潜在的糖基化位点,5’端有一编码19个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶基因工程菌的构建奠定了基础。     

用原生质体诱变选育高植酸酶活的黑曲霉变异株

将 2株黑曲霉菌株 (I,II)在诱导产植酸酶的条件下分别制备成原生质体 ,并考察其原生质体形成及再生 ,经紫外诱变后 ,发现涂平板的黑曲霉 (II)原生质体在再生过程中菌落形态发生明显变化。考查突变菌种的植酸酶酶活 ,筛选到其中一个变异株比原始黑曲霉 (II)亲本株的植酸酶酶活提高了 2 .2倍。