甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。     

辣椒雄性不育系SDH4基因的表达特性分析

为了探究线粒体电子传递复合体Ⅱ的关键酶基因(SDH4)与辣椒细胞质雄性不育的关系,该试验通过GenBank报道的辣椒线粒体基因组序列,特异引物扩增SDH4基因,并通过分析SDH4基因的时空表达及转录本编辑位点,以期找到辣椒细胞质雄性不育系9704A和保持系9704B的差异。结果表明:(1)从辣椒细胞质雄性不育系9704A和保持系9704B中获得的目的基因编码区片段长度一致,全长均为378bp,编码125个氨基酸残基。(2)辣椒保持系不同组织中SDH4基因表达存在差异,种子中表达最高,茎中表达最低。(3)在不同材料花蕾发育的同一时期,SDH4基因表达也不一致,在花粉母细胞减数分裂时期,不育系SDH4基因表达量明显低于保持系;而在造孢细胞增殖期、小孢子单核期和小孢子成熟期的表达量均高于保持系。(4)不育材料中SDH4基因在29位点出现RNA编辑,导致氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸,增强了蛋白结构的疏水性能。研究认为,辣椒细胞质雄性不育系9704A和保持系9704B中SDH4基因的表达差异可能引起植物的能量代谢供应出现异常,从而导致雄性不育的产生。     

大豆GmABI4基因克隆及表达分析

该研究基于大豆基因组数据库,根据拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,经比对分析,获得了大豆中的2个GmABI4基因,分别命名为GmABI4-1(GenBank登录号为XM_014766551.1)和GmABI4-2(GenBank登录号为NM_001249003)。TMHMM软件和系统进化转录分析表明,这2个基因编码的蛋白均不具有信号肽,二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主;进化树分析表明,大豆GmABI4和野生大豆亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,GmABI4-1与GmABI4-2基因在大豆种子与豆荚中的表达量均高于根、茎、叶、花等其他组织,推测可能与调控大豆种子生命活动相关。     

棉花GhZIP4基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR和PCR方法,从陆地棉‘苏棉18’-cDNA和基因组DNA中分别克隆获得了GhZIP4基因片段.结果表明:(1)GhZIP4基因cDNA序列全长1 487 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸残基,其氨基酸序列具有典型的ZIP蛋白特征,预测具有8个跨膜结构域,第Ⅲ和第Ⅳ跨膜结构域间存在可变区,在可变区有2个富含His的结构域“HRHSHPHG”和“HSHGHGHD”.(2)氨基酸进化树分析显示,GhZIP4同拟南芥ZIP家族AtZIP4的相似性较高.(3)GhZIP4 DNA序列编码区全长1 778 bp,包含4个外显子和3个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则.(4)半定量分析显示,GhZIP4基因在茎中表达量最高,表明该基因有可能在某些金属离子地上部和根部的动态平衡分布过程中具有重要作用.     

吸水和干燥条件下发菜核糖体代谢差异表达基因分析

为解析发菜吸水和干燥条件下的基因差异表达规律以及发菜适应"干-湿"水分节律调控机制,该研究以充分吸水发菜藻体为对照组,干燥状态下的发菜藻体为处理组,采用高通量Illumina HiSeq PE150测序平台结合生物信息学分析方法对发菜吸水和干燥条件下的差异表达基因进行分析。结果显示:(1)发菜吸水和干燥条件下共鉴定到差异表达基因3 383个,其中显著上调和显著下调表达的基因数分别为1 767个和1 616个。(2)GO功能富集分析发现,在吸水和干燥条件下发菜差异表达基因主要富集在蛋白质合成与代谢等相关途径中;KEGG显著性富集分析发现,吸水和干燥条件下发菜有46个差异表达基因被显著富集到核糖体代谢途径,且均为显著上调表达,这些基因可能参与发菜对干旱胁迫的响应。(3)随机挑选6个被显著富集到核糖体代谢途径的基因进行qRT-PCR分析发现,其基因相对表达量与转录组测序结果一致。研究表明,发菜在干燥条件下可能通过激活核糖体代谢特定基因表达帮助抗旱相关的蛋白质的合成和正确折叠、并参与渗透调节等重要生理活动进而调控其适应干燥环境条件。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

甘蓝型油菜热激转录因子的克隆及表达分析

以甘蓝型纯系油菜为试材,用RT-PCR和RACE方法首次从油菜种子中获得油菜热激转录因子的cDNA全长序列,命名为BnHSFA4a,GenBank登录号为HQ435241。结果表明:该cDNA长1 667bp,编码1个具有389aa的蛋白质,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥热激转录因子AtHSFA4a编码的氨基酸序列间相似度为82%。对34条编码不同热激转录因子的氨基酸序列进行多重比对,结果在100～190aa处序列间氨基酸总相似性超过60%,显示出较高的保守性。构建原核表达载体并成功表达出预期蛋白。半定量RT-PCR结果显示,该基因的表达先于油菜肌醇半乳糖苷合成酶(BnGOLS1)基因,符合该基因调控BnGOLS1的假设。推测AtHSFA4a基因可能通过调控BnGOLS1的表达量进而在油菜种子脱水耐性获得过程中发挥一定的作用。     

铁皮石斛钙网蛋白基因DoCRT1的分子克隆与表达研究

该研究采用RACE克隆铁皮石斛钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因DoCRT1,进行生物信息学分析,并借助定量PCR检测基因表达模式,为揭示该基因在铁皮石斛生长发育及逆境生理中的分子作用奠定基础。结果表明:(1)DoCRT1基因(GenBank登录号KT957551)cDNA全长1 672bp,ORF长1 275bp,编码一条由424个氨基酸组成的多肽,分子量49.05kD,等电点4.42,具有CRT蛋白保守的钙网蛋白/钙联接蛋白P结构域(205~320)和类伴刀豆球蛋白凝集素/葡聚糖酶结构域A(20~222)以及多个基序;蛋白N端含有一个信号肽(1~23)和一个跨膜区域(8~24),预测结果显示主要定位于细胞液泡、胞外,与多种植物CRT蛋白一致性很高(80%~87%)。(2)DoCRT1蛋白与OsCRT1/2、ZmCRT1亲缘关系近,聚在CRT进化树的CRT1/2分支。(3)qRT-PCR检测结果显示,DoCRT1基因转录本在石斛根中表达量较高,为叶中的2.23倍,且茎与叶中表达量无显著差异。     

龙眼体胚发生过程中DlAGO4基因的克隆及表达分析

该研究基于龙眼基因组数据库,采用RT-PCR技术,以‘红核子’品种龙眼松散型胚性愈伤组织cDNA为模板,进行龙眼胚性愈伤组织DlAGO4基因的克隆和生物信息学分析,并采用实时荧光定量技术分析其在龙眼体细胞胚胎发生不同阶段、不同组织部位、激素和非生物胁迫处理以及5-氮胞苷(5-azac)处理的表达模式。结果表明:(1)DlAGO4基因cDNA全长为3 425 bp,包含开放阅读框长度为2 781 bp,编码926个氨基酸。(2)生物信息学分析表明,DlAGO4蛋白为碱性亲水非分泌蛋白,含有AGO经典的保守结构域PAZ和Piwi,与克莱门柚CcAGO4的同源性最近,含有85个磷酸化位点和2个糖基化位点;亚细胞定位预测其最可能定位于细胞核;MicroRNA预测显示,DlAGO4基因受到4个miRNA靶向调控。(3)qRT-PCR结果表明,DlAGO4在龙眼球形胚阶段和种子中相对表达量最高;激动素、水杨酸、NaCl、甘露醇、PEG-4000和ABA处理均能促进DlAGO4基因的表达,而2,4-D和MeJA处理抑制其表达;不同浓度的5-azac处理1 d和3 d抑制DlAGO4的表达,但从处理第6天开始该基因呈上调表达,并于处理第12天相对表达量最高。研究认为,DlAGO4基因可能参与龙眼球形胚和种子的转录调控,且可能参与KT、SA的激素信号转导途径和NaCl、甘露醇、PEG-4000、ABA的逆境胁迫响应途径以及DNA甲基化调控机制。     

紫花苜蓿UV-B光受体基因MsUVR8的克隆及功能研究北大核心CSCD

该研究采用RACE扩增技术克隆了一个紫花苜蓿UV-B光受体基因(MsUVR8),在生物信息学分析基础上,采用农杆菌介导法获得了该基因过表达愈伤组织,并对UV-B辐射处理后MsUVR8过表达愈伤组织及其野生型中的类黄酮、黄酮醇、花青素、过氧化氢(H_(2)O_(2))、超氧阴离子(O_(2)^(-·))含量以及UV-B信号通路相关基因的表达进行检测分析,以探讨MsUVR8基因的生物学功能,为揭示植物响应UV-B胁迫的分子机制奠定理论基础。结果表明:(1)成功克隆获得紫花苜蓿MsUVR8基因CDS序列834 bp,且MsUVR8与蒺藜苜蓿MtUVR8基因序列相似度高达95%以上;MsUVR8蛋白形成了不完整的β-折叠结构,系统发育分析显示其与鹰嘴豆属于同一分支。(2)对MsUVR8过表达系检测发现,紫花苜蓿MsUVR8过表达愈伤组织(UVR8-OE)中类黄酮含量较野生型愈伤组织(WT)明显升高,而且经UV-B辐射后的UVR8-OE类黄酮物质含量较WT进一步显著升高。(3)DPBA荧光标记实验发现,UV-B辐射大大促进了细胞中黄酮醇的合成,且UV-B辐射后的UVR8-OE中黄酮醇含量最高。(4)DAB和NBT染色显示,UV-B处理后WT中活性氧(H_(2)O_(2)和O_(2)^(-·))的积累增加,而在UV-B辐射处理与未处理的UVR8-OE中H_(2)O_(2)和O_(2)^(-·)的积累无明显差异,表明MsUVR8可增强植物组织细胞的抗氧化性能,并可降低UV-B胁迫引起的氧化损伤。(5)UV-B辐照后,WT中PAL、CHS和FLS表达被激活而显著提高,UVR8-OE中的4种基因表达均达到最大,且较其他3个处理组均显著增强。研究认为,紫花苜蓿MsUVR8被UV-B激活后,促进了类黄酮合成相关基因的表达,并激活了类黄酮合成关键酶的活性,从而提高了类黄酮物质的合成效率,增强了UV-B胁迫条件下植物愈伤组织的抗氧化能力。     

鸭儿芹肉桂酸4-羟化酶基因的克隆与不同温度下的表达分析

为研究鸭儿芹木质素合成相关基因,以贵州省野生鸭儿芹为研究对象,克隆到1条1 631bp长的肉桂酸4-羟化酶(C4H)基因(CjC4 H),并以鸭儿芹生长过程中主要面临的4种不同温度(10℃、18℃、30℃和38℃)处理0、0.5、1、2、4、8、12和24h,考察鸭儿芹木质素合成基因CjC4 H的表达情况,探讨鸭儿芹木质素合成基因受温度的调控关系,为鸭儿芹适宜生长温度的选择提供参考。开放阅读框(ORF)分析显示,CjC4 H基因的开放阅读框(ORF)长度为1 521bp,可编码506个氨基酸,蛋白分子质量为58.13kD,等电点为9.38。进化树分析表明,同科植物之间C4H进化上相对保守。实时定量PCR检测鸭儿芹中CjC4 H基因与温度的响应表达,结果表明38℃高温处理4h时,CjC4 H基因表达量远高于其他温度处理;而10℃和18℃相对低温处理,CjC4 H基因表达在24h时明显提高。     

小麦TaDRLea3 2基因的克隆及胁迫诱导表达分析

胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白) 是植物体中广泛存在的一类与渗透调节相关的家族蛋白,植物受非生物胁迫会大量表达。该研究采用同源克隆技术,从干旱诱导的小麦品种‘郑引1号’ (Triticum aestivum L.)中获得1个新的LEA3家族基因（ TaDRLea3 2）,该基因全长668 bp,编码区为570 bp,编码189个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白为亲水性蛋白,二级结构以α 螺旋为主,含有9个由11个氨基酸组成的保守结构域,为典型的LEA3蛋白,存在3个磷酸化位点,无信号肽结构域及跨膜结构域,可能定位于细胞质中;实时定量PCR结果表明, TaDRLea3 2基因受干旱、高盐、低温诱导表达,同时也受外源ABA诱导,推测 TaDRLea3 2为ABA依赖型 LEA3基因,以不同机制参与小麦对非生物胁迫的应答过程,为深入分析小麦LEA3家族蛋白的抗逆机制奠定了基础。     

棉花抗枯萎病相关转录因子基因的克隆与表达

以枯萎病菌诱导棉花基因表达谱中获得的差异表达bZIP作为探针,采用电子克隆结合RT-PCR方法从棉花抗枯萎病品种‘中棉所12’中克隆了1个TGA转录因子基因,命名为GhTGA2.2。序列分析表明,该基因的cDNA全长1 356bp,编码451个氨基酸,预测分子量为50.04kD,等电点为5.85,含有保守的bZIP结构域。系统进化树分析表明,GhTGA2.2属于bZIP亚家族的TGA转录因子,与拟南芥AtTGA2、烟草NtTGA2.2亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,经枯萎病菌诱导后,GhTGA2.2基因在抗病品种中呈上调表达,随处理后时间的推移,其相对表达量呈先升高后降低的趋势,并于处理后24h表达量达到最大;水杨酸诱导后1h,GhTGA2.2基因相对表达量迅速增加;茉莉酸和乙烯诱导后GhTGA2.2基因的相对表达量明显降低,呈下调表达。研究推测,GhTGA2.2基因可能通过水杨酸信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

黄花棘豆脱水素OoY_2K_4的鉴定及表达分析

该研究以黄花棘豆cDNA为模板,采用同源克隆法,从黄花棘豆转录组数据库中克隆获得1个响应逆境胁迫的胚胎发育晚期丰富蛋白基因,命名为OoY_2K_4;OoY_2K_4基因ORF为786bp,编码261个氨基酸,含有2个保守的Y片段和4个K片段,为典型的Y_2K_4类脱水蛋白亚家族成员;OoY_2K_4蛋白不具有跨膜结构域,不存在信号肽,亲水性极强,含有1个糖基化位点和17个磷酸化位点;亚细胞定位显示,OoY_2K_4蛋白定位于细胞质中。多序列比对发现,OoY_2K_4蛋白与其他物种第二组LEA蛋白(脱水素)序列高度保守;进化树分析显示,该序列与三叶草、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿相似度最高,亲缘关系最近。采用qRT-PCR对OoY_2K_4基因在干旱、高盐、低温以及脱落酸、乙烯、赤霉素处理下的表达分析显示,干旱和高盐胁迫可显著诱导OoY_2K_4基因表达,而低温胁迫下基本无变化;激素处理均可诱导OoY_2K_4基因高效表达,其中脱落酸诱导下OoY_2K_4基因表达最显著。研究推测,OoY_2K_4基因可能通过依赖ABA的信号途径参与黄花棘豆对干旱和高盐逆境胁迫的应答反应。     

Cloning and Sequence Analysis of the Gene Encoding (6-4)photolyase from Dunaliella salina

DNA photolyase can repair UV-induced DNA damage in a light-dependent manner. A cDNA of (6-4)photolyase from Dunaliella salina (GenBank accession number: AY845324) was cloned, sequenced and its amino acid sequence was deduced. The derived amino acid sequence showed high homology with other (6-4)photolyases and a predicted 3D model was constructed by homology modeling. Revisions requested 20 May 2005 and 18 August 2005; Revisions received 2 August 2005 and 28 November 2005     

Molecular Cloning and Characterization of a Gene Encoding Eukaryotic Initiation Factor iso4E in Tomato (Solanum lycopersicum)

The eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) and its isoform, eIF(iso)4E, play important roles in protein translation and recently reported to be involved in plant–virus interactions. A cDNA encoding the tomato eIF(iso)4E was cloned based on a tentative consensus (TC170275) in TIGR (), and was designated as SleIF(iso)4E, with an open reading frame of 603 nucleotides encoding a protein of 200 amino acids. The calculated molecular weight of the SleIF(iso)4E protein was 22.85 kD, and the theoretical isoelectric point was 5.76. The amino acid sequence of SleIF(iso)4E showed 66–91% identity with eIF(iso)4Es in pepper, tobacco, pea and maize, and 44–51% identity with eIF4Es from other plants. The phylogenetic relationship and tertiary structure comparisons indicate that SleIF(iso)4E share high homology and strict conserved regions with other members of the eIF4E family, a characteristic of all members of this family. Semi-quantitative RT-PCR showed varying expression levels of SleIF(iso)4E in different tissues. By comparing eIF(iso)4E coding sequences between resistant and susceptible tomato genotypes, correlation between sequence variations and virus resistance was identified. These findings provide good grounds for future research on the role of SleIF(iso)4E in translation initiation and plant–virus interactions. Sequence data of SleIF(iso)4E from this article have been deposited at GenBank under accession number EU119958.     

The optical biosensor study of the redox partner interaction with the cytochrome P450 2B4-containing monooxygenase system under hydroxylation conditions

The interactions between cytochrome P450 2B4 (d-2B4), NADPH:cytochrome P450 reductase and cytochrome b5 have been investigated in the monomeric reconstituted P450 2B4-containing monooxygenase system in the presence of a substrate (7-pentoxyresorufin) and an electron donor, NADPH. Each partner was immobilized via its amino groups on the carboxymethyldextran biochip surface of the optical biosensor IAsys+. Such mode immobilization was not accompanied by any loss of activities of the immobilized proteins. The formation of binary d-Fp/d-2B4 complexes was registered. The association/dissociation rate constants (k_on/k_off) were (0.013 ± 0.005) × 10⁶ M^?1 s^?1/0.05 ± 0.02 s^?1, and dissociation constant (K_D) was (0.26 ± 0.13) × 10^?6 M. Comparison of k_on, k_off and K_D values for d-Fp/d-2B4 complexes formed under hydroxylation (O-dealkylation) with corresponding constants obtained for the oxidized proteins of (0.10 ± 0.03) × 10⁶ M^?1 s^?1/(0.14 ± 0.06) s^?1, and (0.71 ± 0.37) × 10^?6 M, respectively shows that the decrease in k_on and an insignificant decrease in K_D are associated with the increase of complex lifetime during transition from the oxidized to hydroxylation conditions. Complex formation between d-Fp and d-b5 was not registered in both hydroxylation conditions and in the case of oxidized forms of these proteins. In both cases formation of the ternary d-Fp/d-2B4/d-b5 complexes occurred.