三株牛源亚洲1型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的亚洲1型口蹄疫病毒(分别命名为F1、F2、F3)为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计1对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的片段,并测定了3个毒株VP1基因的序列.结果表明,3株亚洲1型FMDV毒株VP1基因长度均为633 bp,编码211个氨基酸.3株毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在82.8% ～99.1%之间,推导氨基酸序列同源性在89.1% ～99.1%之间.从系统发生树看,F1株与我国香港2005年牛毒株序列同源性99.5%,属同一遗传谱系,F2株、F3株与2005年引起河北省万全县、北京市延庆县、甘肃静宁县疫情的毒株分属同一个基因群.     

6株0型口蹄疫病毒结构蛋白vpl基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来。克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vpl基因的核苷酸序列同源性在95％～99．8％之间,氨基酸序列同源性在94．8％～100％之间。T1-T6六株病毒vpl基因的核苷酸序列与已经发表的O／HKN／14／82、O/TAW/81,97、O／PHI／7／96、O／HKN／1／99和O／HKN／16／96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86．1％～95．8％之间：发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性。故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDV O型中国拓朴型(Cathay topotype)。     

传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较

对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析。结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异。其中有一个是真正的超强毒,即GX8／99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多。在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96．8％～99．5％,在氨基酸(aa)水平为96．6％～100％o而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91．7％～93．6％和91．8％～93．2％。说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系。特别是SD-1／97、SD-3／98、JS-30／99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98．4％和98．6％以上,SD-3／99、JS-30／99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100％。然而,致病性特别高的GX8／99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96．8％～9712％和96．6％～97．9％。相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8／99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异。     

6株O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来.克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.8%～100%之间.T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86.1%～95.8%之间;发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性.故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDV O型中国拓朴型(Cathaytopotype).     

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CV1988／Ripens株、强毒株GA、超剜毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株Jing-1及3个中国野毒株。结果表明：MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96．7％～100％之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99．2％～100％之间。尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。     

引起产科新生儿腹泻暴发的轮状病毒株VP4 VP7编码基因与其毒力关系的探讨

克隆并测定了引起产科新生儿腹泻暴发的P2[6]、G4型轮状病毒(BN株)VP4的VP8片段和VP7编码基因的核苷酸序列,并据此推导出其氨基酸序列。与相应标准株和地方株(包括有毒株和无毒株)比较的结果表明,所测VP8序列与相同型别(P2[6])的标准株M37(无毒株)和ST3(无毒株)、地方株N16(无毒株)和VE7156(有毒株)之间的同源性为92.8％～98.6％,胰酶作用位点各毒株间相同;位于aa49、aa50、aa52、aa53、aa78处的氨基酸在有毒株与无毒株间(包括BN株)不同,但分别保守。VP7基因与同型(G4)标准株ST3(A亚型/无毒株)和VA70(B亚型/有毒株)、意大利地方株PV5249(A亚型/有毒株)和北京地方株CR117(有毒株)、同型猪有毒株Gott之间的同源性为91.4％～97.8％,其中与A亚型的同源性为95.5％～96.3％,而与B亚型的同源性为91.4％,提示VP7为G4A亚型,位于aa38、aa78、aa145、aa238位点的氨基酸在有毒株与无毒株之间不同,但分别保守。分析了虽为P2[6]型却反常地引起新生儿腹泻暴发毒株(BN)的VP8与VP7基因的变异情况,并对轮状病毒毒力与VP4、VP7基因变异的相互关系进行了讨论,为慎重确定轮状病毒疫苗候选毒株提供理论依据。     

6株O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来。克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.8%～100%之间。T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86.1%～95.8%之间;发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性。故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDVO型中国拓朴型(Cathaytopotype)。     

禽Ⅰ型副粘病毒f基因克隆及序列分析

用RT—PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽Ⅰ型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其f基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽Ⅰ型副粘病毒各毒株同源性为88．1％--94．9％,与疫苗株LaSota和强毒株F48E9的同源性为85．6％。所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112—117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株。鸽Ⅰ型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMVZQ98—1株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株。以1662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒届于基因Ⅶ型,鸽Ⅰ型副粘病毒届于基因Ⅵ型。     

猪细小病毒SD-68株vp2基因的克隆及序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株印2基因进行的克隆和序列测定表明：SD-68株VP2基因全长1740bD,编码579个氨基酸残基组成的多肽;PPVSD-68株与Kresse株、SY-99株、NADL-2(5075)株、NADL-2(4973)株、US-1株的VP2基因比较,核苷酸的同源性在99％以上,氨基酸的同源性在96％以上。进化树分析表明SD-68株与kresse株的亲缘关系最近;在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),SD-68株与kresse株的差异最小,据此推测SD-68株的组织嗜性与Kresse株相似,即SD-68株属皮炎型PPV;而比较弱毒株NADL-2、SD-68和强毒株kresse VP2的氨基酸差异后发现,215、378和383可能是决定PPV致病性强弱的关键位点。     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测

用分子克隆技术从兔出血症病毒(RHDV)中国早期流行株NJ85中成功克隆出vp60基因,序列分析表明基因长度为1740nt,编码579aa。利用GenBank数据库,NJ85与WX84、TP二个RHDV中国毒株vp60基因DNA序列的同源性分别为92．7％和97．2％,氨基酸序列的同源性分别为96．1％和98．6％,与其他国家16个毒株的vp60基因DNA序列的同源性在83．7％-97．0％之间,氨基酸序列的同源性在90．5％～99．0％之间,具有高度的同源性。进一步分析vp60基因的六个分区,A、B、D、F四个区变异率较低,C、E二个区变异率较高。在遗传进化上,历年来的RHDV毒株在氨基酸水平上分析可分为三个支谱系,在核苷酸水平上趋向四个支谱系,谱系没有呈现地域或时间特征。三个中国毒株分布在二个不同的支谱系中。与RHDV同为兔病毒属的欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)组成了另一个谱系。运用生物信息学方法分析了NJ85 VP60蛋白的分子量、等电点、疏水性和二级结构,根据同源模型预测分析了三级结构。NJ85 VP60的二级结构以B片层为主,三级结构稳定。病毒衣壳表面有32个杯状凹陷,由90个二聚体组成,二聚体由VP60单体以A／B5和C／C2两种方式构成,单体在二聚体中的构象有A、B、C三种形式。单体含有S、P两个结构域,两者通过柔性绞链连接,P结构域由VP60的C端部分形成,P分为P1和P2二个亚结构域,P2位于病毒衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点。     

三株口蹄疫病毒的克隆和基因型鉴定

目的：将O、A、Asia—Ⅰ型等3株口蹄疫病毒（FMDV）VP3-VP1—2A区域的一个片段克隆到pMD18-T载体上,构建阳性重组质粒,并且鉴定3株病毒所属的基因型。方法：将从中国农业科学院兰州兽医研究所获得的O、A、Asia—Ⅰ型灭活FMDV提取RNA作为模板,采用RT-PCR技术扩增了VP3-VP1-2A区域的一个约1070bp的片段,包含了全部的VP1序列;将其克隆到pMD18-T载体上,鉴定后得到阳性重组质粒;将目的片段进行序列测定、分析、绘制系统发育树,进而确定各灭活病毒的基因型。结果与结论：经鉴定,O型灭活FMDV属Cathay基因型,它与该基因型3条参考毒株序列的相似性在87％以上;A型灭活FMDV与参考株的相似性差异较大,但在系统发育树上可以看出该毒株属于Asia基因型;Asia-Ⅰ型FMDV只有1个基因型,将测序结果在NCBI网站上BIJAST,证实该灭活病毒为Asia—Ⅰ型。     

传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较

对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析.结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异.其中有一个是真正的超强毒,即GX8/99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多.在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96.8%～99.5%,在氨基酸(aa)水平为96.6%～100%.而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91.7%～93.6%和91.8%～93.2%.说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系.特别是SD-1/97、SD-3/98、JS-30/99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98.4%和98.6%以上,SD-3/99、JS-30/99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100%.然而,致病性特别高的GX8/99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96.8%～97.2%和96.6%～97.9%.相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8/99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异.     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了 Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长 2199 个碱基,编码 733 个氨基酸,该基因与 Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的 p1 基因核苷酸序列同源性分别为 88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为 94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与 Ind63/72、Pka3/54、Israel株的 vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在 42-50 位和 137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达 90%以上,本实验为进一步研究 A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上.本研究首次成功测定了Asia1型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因(p1区)的核苷酸序列,全长2199个碱基,编码733个氨基酸,该基因与Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2毒株的p1基因核苷酸序列同源性分别为88.4%、86.0%、89.3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与Ind63/72、Pka3/54、Israel株的vp1、vp2、vp3、vp4基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在42-50位和137-156位.实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达90%以上,本实验为进一步研究A-sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础.     

犬瘟热病毒TN株血凝基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法对分离的TN野毒株H基因进行了扩增 ,并将其克隆到pGEM T载体上 ,进行核苷酸序列测定。结果TN野毒株H基因ORF全长 1 ,81 5bp ,编码 60 4个氨基酸。与GenBank中己报道的 7个CDV毒株相比 ,H基因核苷酸序列的同源性在 92 %～ 99%之间 ,推导的H蛋白氨基酸序列的同源性在 91 %～ 99%之间。TN株H蛋白潜在的N 联糖基化位点为 8个 ,而Onderstepoort弱毒株H蛋白为 4个 ;其中N端第 1 9～ 2 1、 30 9～ 31 1、 5 8     

一株基因Ⅱ型新城疫强毒株的分子特性

从患病肉鸡群分离到一株新城疫病毒(NewcastleDiseasevirus,NDV)SQZ04。经蚀斑纯化后接种40日龄SPF鸡可诱发典型病变。经蚀斑纯化前和后的MDT为50·5h和51·2h,ICPI为2·0和1·92,IVPI为2·8和2·68,表明属强毒株。但F基因分型表明SQZ04属基因Ⅱ型,而且其与已知基因Ⅱ型的疫苗株LaSota、B1和Texas48的同源性分别为99·3%、98·7%和96·9%,显著高于与基因Ⅶ或Ⅸ型强毒株的同源性88·3%~88·6%或91·3%~92·1%。这是国内第一株属于基因Ⅱ型的NDV强毒株。SQZ04F多肽氨基酸裂解位点的序列为111GGRQGRL117,与弱毒株序列完全相同,这也是国内外首次报道具有这一氨基酸序列的强毒野毒株。然而,SQZ04株与其他已知强毒株的HN氨基酸同源性高达95·3%~97·3%,显著高于与弱毒株LaSota等的同源性87·8%~89·5%。     

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCVDXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株s基因相比,s基因核苷酸序列同源性在40．2％-99．5％之间;推导的氨基酸序列同源性在15．9％-99．O％之间。DXMV株s基因变异区主要集中在该基因前1／2处,其中350．370、439．478、1718．1818三个区域碱基变异较大,而1060．1700区却十分保守。基于s全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和USpatent株亲源关系最近。推导的DXMV株s蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc．1弱毒多一个;其中第566．568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。     

猪细小病毒SD-68株vp2基因的克隆及序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株vp2基因进行的克隆和序列测定表明SD-68株VP2基因全长1740bp,编码579个氨基酸残基组成的多肽;PPV SD-68株与Kresse株、SY-99株、NADL-2(5075)株、NADL-2(4973)株、US-1株的VP2基因比较,核苷酸的同源性在99%以上,氨基酸的同源性在96%以上.进化树分析表明SD-68株与kresse株的亲缘关系最近;在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),SD-68株与kresse株的差异最小,据此推测SD-68株的组织嗜性与Kresse株相似,即SD-68株属皮炎型PPV;而比较弱毒株NADL-2、SD-68和强毒株kresse VP2的氨基酸差异后发现,215、378和383可能是决定PPV致病性强弱的关键位点.     

手足口病病例肠道病毒CVA12型的鉴定及VP1基因特征分析

目的运用分子生物学方法对长沙市1例手足口病(Hand foot and mouth Disease,HFMD)患者咽拭子标本进行未分型肠道病毒的鉴定及VP1基因特征分析。方法采用兼并引物RT-PCR扩增病毒VP1区片段,BLAST比对确定其型别;特异性引物扩增VP1区基因全长,测定序列进行分析。结果所得序列BLAST比对分析为Coxsackievirus A12(CVA12)型肠道病毒;病毒VP1区基因序列全长为888bp,编码296个氨基酸,同源性分析显示与国内外CVA12毒株核苷酸同源性介于81.9%~98.4%之间;氨基酸同源性在95.3%~100.0%之间。与CVA12美国标准株Texas-12核苷酸同源性为81.9%,氨基酸同源性为95.3%。系统进化表明,长沙市CVA12与国内毒株亲缘关系较近,而与日本、美国则亲缘关系较远。结论从1例手足口病轻症病例中鉴定出CVA12型肠道病毒,该病毒VP1区基因进化特征与国内CVA12毒株亲缘关系近。