芽胞外壁基质组成蛋白的编码基因启动子PexsY指导的cry1Ac基因表达

【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达Cry1Ac晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过β-半乳糖苷酶活性分析了PexsY启动子和截短的PexsY启动子的转录活性;利用该启动子在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD73菌株中表达了cry1Ac基因,通过透射电子显微镜观察晶体形态;蛋白定量、SDS-PAGE比较蛋白产量;生物活性测定进行功能验证。【结果】PexsY启动子在芽胞晚期转录活性很高,透射电镜观察到利用该启动子表达的cry1Ac基因形成了菱形晶体,SDS-PAGE分析可以检测到133kDa的Cry1Ac蛋白,且与cry3A启动子指导表达的蛋白产量相近,少于cry8E启动子指导表达的蛋白产量;生物活性测定表明PexsY指导表达Cry1Ac蛋白对玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有杀虫活性。【结论】在Bt无晶体突变体中,非cry基因启动子PexsY可以正常表达133kDa的Cry1Ac蛋白,并形成晶体,具有在芽胞形成晚期表达cry基因的能力,该类启动子将在Bt工程菌构建中发挥重要作用。     

苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建

[目的]通过比较cry1A、cry3A、cry4A和cry8E四个基因的启动子转录活性,筛选出一个强启动子,利用强启动子构建一个苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)高效表达载体.[方法]利用启动子融合lacZ技术检测了4种启动子的转录活性.通过扫描电子显微镜观察晶体、SDS-PAGE、蛋白定量和生物活性测定等方法对新建高效表达载体进行功能验证.[结果]构建了Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E4个启动子融合报告基因lacZ的表达载体,经β-半乳糖苷酶活性分析得知,启动子活性从高到低依次为Pcry8E＞Pcry1A＞Pcry4A＞Pcry3A.选取cry8E启动子,以pHT315作为基础载体构建苏云金芽胞杆菌高效表达载体pHT315-8E21b,将cry1Ac基因连接到pHT315-8E21b和广泛应用的cry3A启动子指导的pSXY-422b上,分别转入无晶体突变株HD-73-,获得菌株HD-8E1Ac和HD-422-1Ac.扫描电子显微镜观察显示,HD-8E1Ac菌株可以形成菱形晶体,说明正确表达了cry1Ac基因.SDS-PAGE分析结合蛋白定量实验表明pHT315-8E21b表达效率高于pSXY-422b.对小菜蛾(Plutella xylostella)的生物活性测定表明HD-8E1Ac菌株对小菜蛾有生物活性,且菌株活性高于HD-422-1Ac.[结论]利用强启动子Pcry8E构建了一个能在Bt中高效表达的穿梭载体pHT315-8E21b,该载体可正确表达cry1Ac基因,其表达效率高于被广泛应用的pSXY422b.     

四种cry 基因启动子在spoIIID基因突变株中的活性比较

【目的】分析spoIIID基因突变对苏云金芽胞杆菌cry1、cry3、cry4和cry8基因启动子Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E的影响,比较以上启动子在无芽胞spoIIID基因突变体(HD-△SpoIIID)中的转录活性。【方法】分别构建了Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E与lacZ基因融合的转录分析载体,并导入HD-73野生型菌株和HD-△SpoIIID突变株中测定β-半乳糖苷酶活性;通过高温诱变方法在HD-△SpoIIID基础上筛选出缺失cry1Ac基因的HD--△SpoIIID突变体;构建了4种启动子与cry1Ac基因融合表达载体,分别将它们转入HD-ΔSpoIIID和HD--ΔSpoIIID中,分析Cry1Ac蛋白表达量及其生物活性。【结果】HD-73和HD-ΔSpoIIID菌株中四个启动子转录活性由高到低分别为:Pcry8E>Pcry1Ac>Pcry4A>Pcry3A;spoIIID基因的缺失未影响Pcry1Ac和Pcry8E转录活性,Pcry3A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性略有升高,Pcry4A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性在T5到T10略有降低。从翻译水平来看在HD-ΔSpoIIID中cry8E启动子略低于cry1Ac启动子,并高于Pcry4Aa,Pcry3A指导的Cry1Ac蛋白产量,生物活性测定结果与蛋白表达量相符。【结论】cry8E基因启动子Pcry8E在spoIIID突变体中在转录水平活性是最高的启动子,而cry1Ac启动子指导自身基因cry1Ac表达时,在翻译水平上略高于cry8E启动子指导的Cry1Ac产量。     

大肠杆菌中利用苏云金芽胞杆菌强启动子p1Ac指导Cry1Ac蛋白表达的特性分析

对利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)强启动子——cry1Ac基因启动子p1Ac指导cry基因在大肠杆菌中的表达进行了研究。结果显示,大肠杆菌中由启动子p1Ac指导表达的Cry1Ac蛋白与苏云金芽胞杆菌来源的Cry1Ac蛋白在碱溶性、胰蛋白酶活化、杀虫活性等方面有较好的一致性,从而解决了目前商业化载体大肠杆菌表达cry基因时形成不易溶解的包涵体问题。同时,还对p1Ac指导的cry1Ac基因在大肠杆菌中表达的发酵条件进行了初步探索。     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Southern杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌(\%Bacillus thuringiensis)\% YBT1520菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其5’末端所在HindⅢ片段分别为68kb和46kb,它们对应的基因分别命名为cry218和cry46。经PCR鉴定,该菌含有cry1Aa\,cry1Ab和cry1Ac基因,以及cry2基因,其中cry218属于cry1Ac。分析了cry218基因4190bp的核苷酸序列,在杀虫晶体蛋白基因分类系统中被命名为cry1Ac10。结合Southern杂交和PCR结果可判断3个cry1A基因的拷贝数不同,其中cry1Ac拷贝数最高,YBT1520菌株与其它库斯塔克亚种的杀虫晶体蛋白基因所在限制性内切酶位置明显不同。     

苏云金芽胞杆菌中荧光分析融合杀虫晶体蛋白的形成

为研究苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白在细胞中的定位及在细胞中的形成, 构建了Cry1Ac-GFP融合蛋白, 大小约为160 kD. 将携带cry1Ac启动子的cry1Ac-gfp融合基因片段克隆到pHT304载体上, 获得融合表达载体pHTcry1Ac-gfp. pHTcry1Ac-gfp转化到无晶体突变株HD-73 cry-中, 获得融合表达菌株HD-73-(pHTcry1Ac-gfp). gfp基因通过同源重组插入到HD-73内源大质粒pHT73上cry1Ac基因的3′端, 获得原位融合表达菌株HD-73Φ(cry1Ac-gfp)3534. 激光共聚焦显微镜和Western杂交分析表明, 不对称隔膜形成时, HD-73-(pHTcry1Ac-gfp)和HD-73Φ(cry1Ac-gfp)3534细胞中检测到Cry1Ac-GFP融合蛋白的表达. 融合蛋白颗粒在细胞中的聚集存在一定的极性, 分布于母细胞不对称隔膜附近. Cry1Ac-GFP和Cry1Ac蛋白对小菜蛾的杀虫活性在95%置信区间内没有明显差异.     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa操纵元蛋白对杀虫蛋白晶体形成作用的研究

利用重叠PCR的方法,通过两次PCR扩增,分别获得cry2A10操纵元的orf1、orf1 orf2与cry2Ab5基因的融合片段。融合片段经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切与pHT315连接,分别构建了基因融合片段的原核表达载体pFU(orf1 2Ab)和pFU(orf1 orf2 2Ab),电转化Bt无晶体突变株4Q7后,扫描电镜下可观察到典型的方形晶体,通过SDS-PAGE可检测到60kD大小的蛋白表达带。结果表明,cry2Ab5可在cry2a0的启动子帮助下有效转录和表达,并在orf2产物帮助下形成蛋白晶体。     

利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含cry1Ac10基因的解离载体

将cry1Ac10基因和苏云金芽胞杆菌的复制起始区连 接在一起,并在其两侧按相同方向各连接一个来自苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离位点,构成转移单位。再将革兰氏阳性细菌的抗性标记基因和大肠杆菌克隆载体pUC19与之连接,获得含cry1Ac10基因的解离载体pBMB801。将其转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变体,再导入含解离酶基因的辅助质粒pBMB1200。在解离酶作用下,两个解离位点间发生重组,消除基在操作中的抗性标记基因等非必需基因片段,获得仅保留有完整cry1Ac10基因和来 自苏云金芽胞杆菌质粒复制起始区,在无抗生素选择压力下能稳定遗传的重组质粒pBMB801B 。     

Bt菌株QCL-1中cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究

目的:从高毒力Bt菌株中克隆cry2Ac10基因,并研究其表达和杀虫活性。方法:以Bt菌株QCL-1质粒为模板,利用cry2特异性引物FY2A5和FY2A3进行PCR扩增,将目的片段克隆到表达载体pET-21b( ),构建T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测基因表达情况,然后对表达产物进行生物活性测定。结果:从菌株QCL-1中克隆出目的基因,该基因的编码框由1 872个碱基组成,编码的蛋白质由623个氨基酸组成,与已报道的Cry2Ac氨基酸同源性为97.4%~99.7%。该基因(GenBank accession EF405952)已被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry2Ac10。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达70kDa的蛋白,表达产物对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾幼虫具有高毒力,同时对甜菜夜蛾幼虫生长有抑制作用,其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的LC50分别为30.0μg/g和16.7μg/g。结论:成功克隆和表达了cry2Ac10基因,并明确了cry2Ac10蛋白的活性,为该基因的研究和应用奠定基础。     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa操纵元蛋白对杀虫蛋白晶体形成作用的研究

利用重叠PCR的方法,通过两次PCR扩增,分别获得cry2Aa10操纵元的orf1、orf1+orf2与cry2Ab5基因的融合片段。融合片段经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切与pHT315连接,分别构建了基因融合片段的原核表达载体pFU(orf1+2Ab)和pFU(orf1+orf2+2Ab),电转化Bt无晶体突变株4Q7后,扫描电镜下可观察到典型的方形晶体,通过SDSPAGE可检测到60kD大小的蛋白表达带。结果表明,cry2Ab5可在cry2Aa10的启动子帮助下有效转录和表达,并在orf2产物帮助下形成蛋白晶体。     

Comparative study on effect of different promoters on expression of cry1Ac in Bacillus thuringiensis chromosome

AIMS: The aim of this work was to investigate the effect of cry3A promoter on the expression of cry1Ac in Bacillus thuringiensis chromosome and stably enhance the production of different cry genes under the control of cry3A promoter. METHODS AND RESULTS: The cry1Ac gene, which is specific to Lepidopteran larvae, was integrated into the chromosome of a B. thuringiensis plasmid-free and acrystalliferous strain BMB171, under the control of cry3A promoter and cry1Ac promoter, respectively. The expression of cry1Ac genes in the chromosome of host strain was investigated. The results from sodium dodecyl sulfate-polyacrymide gel electrophoresis, crystal observation and bioassay showed that either integrated with cry3A promoter (cry3Apro-cry1Ac) or with its native promoter (cry1Acpro-cry1Ac), cry1Ac gene could efficiently and stably express in the chromosome. The production of cry3Apro-cry1Ac gene was higher than that of cry1Acpro-cry1Ac gene. CONCLUSIONS: The cry3A promoter enhanced the expression of cry1Ac gene efficiently either on the chromosome or on the plasmid in B. thuringiensis strain. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: So far, the comparative studies on cry3A promoter and other cry promoters were carried on B. thuringiensis plasmids. This system offers an additional method for potentially improving the efficacy of B. thuringiensis insecticidal proteins efficiently, stably and safely.     

Expression of a recombinant Cry1Ac crystal protein fused with a green fluorescent protein in Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Cry-B

To investigate the co-expression and crystallization of a fusion gene between the Bacillus thuringiensis crystal protein and a foreign protein in B. thuringiensis, the expression of the Cry1Ac fused with green fluorescent protein (GFP) genes in a B. thuringiensis Cry(-)B strain was examined. The cry1Ac gene was cloned in the B. thuringiensis-E. coli shuttle vector, pHT3101, under the control of the native cry1Ac gene promoter, while the GFP gene was inserted into the XhoI site upstream of the proteolytic cleavage site, in the middle region of the cry1Ac gene (pProAc-GFP). The B. thuringiensis Cry(-)B strain carrying pProAc-GFP (ProAc-GFP/CB) did not produce any inclusion bodies. However, the transformed strain expressed fusion protein forms although the expression level was relatively low. Furthermore, an immunoblot analysis using GFP and Cry1Ac antibodies showed that the fusion protein was not a single species, but rather multiple forms. In addition, the N-terminal fragment of Cry1Ac and a non-fused GFP were also found in the B. thuringiensis Cry(-)B strain after autolysis. The sporulated cells before autolysis and the spore-crystal mixture after autolysis of ProAc-GFP/CB exhibited insecticidal activities against Plutella xylostella larvae. Accordingly, the current results suggest that a fusion crystal protein produced by the transfomant, ProAc-GFP/CB, can be functionally expressed but easily degraded in B. thuringiensis.     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP,用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白。同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体．pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133．3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高。生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的。     

苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达

[目的]本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究.[方法]本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力.[结果]经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130 kDa和60 kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902 bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12.重组表达质粒pET-2Aa在E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65 kDa表达蛋白.生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4 μg/mL和22.3μg/mL.[结论]菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义.     

Identification of cry-Type Genes on 20-kb DNA Associated with Cry1 Crystal Proteins from Bacillus thuringiensis

Heterologous DNA fragments (20-kb) associated with Cry1 crystal proteins (protoxins) from a soil-isolated Bacillus thuringiensis strain 4.0718 were isolated and analyzed. RFLP patterns of the PCR products showed that the 20-kb DNA fragments harbored cry1Aa, cry1Ac, cry2Aa, and cry2Ab genes. Furthermore, a 4.2-kb DNA fragment, which contained the promoter, the coding region, and the terminator of cry1Ac gene, was cloned from the 20-kb DNAs by PCR, and then the cry1Ac gene was expressed in an acrystalliferous B. thuringiensis strain 4Q7 by using E. coli-B. thuringiensis shuttle vector pHT3101. SDS-PAGE and microscopy studies revealed that the recombinant could express 130-kDa Cry1Ac protoxin and produce bipyramidal crystals during sporulation. Bioassay results proved that crystal-spore mixture from the recombinant was toxic to Plutella xylostella. This was the first report of cry-type genes present on 20-kb DNA associated with Cry1 protoxins of B. thuringiensis.     

苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchiB基因 (去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点)构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆,将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315,分别构建重组质粒pHUAccB6、pHUAccB7,在大肠杆菌中扩增后,将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株XBU001中,获得重组菌株HAccB6和HAccB7。经液体双相胞晶分离提取离心后,将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析,双价基因重组与cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较,几丁质酶活性提高5.2倍,双价重组蛋白表达量显著提高,主要产生130kDa蛋白条带。经定量分析：双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的61.38%;Cry1Ac蛋白占总蛋白量的42%。发酵上清液经60％硫酸铵沉淀,显示出一条分子量为18kDa新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察,表达后的重组蛋白呈菱形或椭原形晶体,其规格约为1.5×3.0μm;经生测分析,重组菌株HAccB6和 HAccB7毒力相近,与HAc菌株比较毒力提高4.5倍,对棉铃虫（Helicourpa armigora）具有高效杀虫活性,其3d LC₅₀值分别为9.1μg/mL和11.34μg/mL。研究结果表明,烟草几丁质酶与cry1Ac双价基因重组表达产物具有杀虫增效作用。     

对鳞翅目害虫高毒力的Bt cry1Aa基因的分离克隆及表达

Bt菌Ly30株是我国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌,经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定,它含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法, 设计一对特异引物,分别引入NcoⅠ和BamHⅠ/NcoⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因,与表达载体Pkk233-2相应酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Aa基因重组质粒pKKLy1Aa。完成了该基因的亚克隆和序列测定,结果表明,该基因的编码区为3 531 bp,编码蛋白分子量为133.2kD,含1.176个氨基酸,等电点Pi为4.99。该基因序列已在GenBank中登记注册,登录号为AF384211,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Aa12。对重组菌KKLy1Aa进行诱导表达研究。在0.6 mmol/L IPTG、37℃、8 h培养条件下,该基因获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133.2 kD蛋白带。室内生测结果表明,Cry1Aa蛋白对不同的小菜蛾品系均有较高的杀虫活性,其LC₅₀值分别为0.203 μg/mL和0.554 μg/mL。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。