蜕皮激素对家蚕卵黄原蛋白基因表达的调控

蜕皮激素（20-hydroxy ecdysone,20E）是由前胸腺分泌的能调节节肢动物昆虫纲、甲壳纲等动物蜕皮的激素. 家蚕属于完全变态昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育时期. 20E在家蚕发育过程中有不可替代的作用. 本研究通过酶联免疫吸附反应（ELISA）测定家蚕变态期前后血淋巴中20E滴度,发现在卵黄原蛋白基因 (Bombyx mori vitellogenin, BmVg) 高量表达前的雌雄血淋巴中20E含量没有明显差异,但含量变化趋势与BmVg表达趋势相一致. 用20E注射上蔟后60 h的家蚕和添食5龄家蚕, 能诱导雌性和雄性脂肪体中BmVg表达和蛋白合成. 调查处理后的家蚕所产卵中的卵黄磷蛋白（BmVn）含量及重量,发现蚕卵中BmVn含量及蚕卵重量都明显增加|本研究还通过脂肪体体外培养,证明了20E是直接作用于脂肪体来诱导BmVg的表达. 本研究结果表明,20E是通过诱导脂肪体中BmVg的转录来增加蚕卵中BmVn积累,从而最终使得蚕卵重量也相应增加.     

昆虫卵黄原蛋白受体的研究进展

昆虫卵黄发生的一个重要过程是卵黄蛋白的摄取,已有的研究表明脂肪体合成的卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)是通过受体介导的内吞作用(receptor mediated endocytosis,RME)被正在发育的卵母细胞所摄取。昆虫卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)是介导昆虫卵黄原蛋白胞吞作用主要受体,它属于低密度脂蛋白家族,在结构与特性上具低密度脂蛋白家族的共性。卵黄原蛋白及其受体在昆虫生殖过程中起着重要的作用,本文综述了昆虫VgR的基本特性、分子结构及表达调控等方面的研究进展。     

亚洲玉米螟卵黄原蛋白受体基因的克隆及在UV-A胁迫下的表达分析

[目的]本文旨在克隆亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis卵黄原蛋白受体(VgR)基因,分析其表达模式,探索UV-A胁迫对亚洲玉米螟VgR基因表达的影响.[方法]利用RT-PCR与RACE技术克隆亚洲玉米螟VgR基因的全长序列;运用生物信息学方法分析该基因特征;采用RT-qPCR技术检测不同发育阶段(卵、1-...     

昆虫卵黄原蛋白受体( VgＲs) 及其主要功能综述

卵黄原蛋白受体(VgRs)属于低密度脂蛋白受体家族成员,具有该家族典型的保守结构域,包括配体结合域,表皮生长因子前体同源域,跨膜域,O-联糖功能域,以及胞质尾域。昆虫VgRs通常具有卵巢特异性,是卵黄原蛋白Vg的专一性胞吞作用受体,可介导Vg进入昆虫卵母细胞,而后沉淀积累形成昆虫生殖必须的卵黄蛋白YP。VgRs介导的胞吞作用是一个动态循环过程,它是卵黄发生的基础,对昆虫卵母细胞发育起着至关重要的作用。近年来的研究表明,VgRs不仅与卵巢激活、卵黄发生与卵子形成密切相关,而且在昆虫信息交流、社会分化、行为构建以及免疫调控等中也起到了至关重要的作用,已成为潜在的害虫控制新靶标。本文首次对昆虫VgRs基因的序列信息,分子结构,系统进化,表达模式以及调控功能等方面进行了综述,旨在为了解VgRs基因的研究进展及前景提供参考,对进一步改进害虫生态控制的策略和措施也具有指导意义。     

黑尾叶蝉卵黄原蛋白受体基因cDNA的克隆、序列分析及表达模式

【目的】卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)属于低密度脂蛋白受体,通过介导内吞作用为发育中的卵母细胞摄取卵黄原蛋白,为胚胎发育提供营养物质,在昆虫生殖过程中发挥关键作用。为研究黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps VgR(NcVgR)基因的生理功能及其在生殖中的作用,本研究克隆并解析了NcVgR基因的序列,并对其时空表达进行了研究。【方法】根据黑尾叶蝉转录组数据信息,利用RT-PCR克隆了NcVgR基因,并进行了生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR研究了不同发育时期、成虫不同组织NcVgR的表达水平。【结果】NcVgR c DNA序列全长6 676 bp,开放阅读框长度5 568 bp,编码1 855个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为206 k D,N端前17个氨基酸为信号肽。序列分析显示,NcVgR具有低密度脂蛋白家族的5个经典保守域,即:配体结合域(ligand-binding domain,LBD)、表皮生长因子前体同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)、O-糖链结构域(O-linked sugar domain,OLSD)、跨膜域(transmembrane domain,TMD)和胞质尾域(cytoplasmic domain)。系统发育分析表明,NcVgR与褐飞虱N.lugens VgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,NcVgR转录起始时间为5龄若虫,羽化后转录水平逐渐上升,至羽化后8 d达到峰值,随后下降。有意思的是,随着黑尾叶蝉产卵,NcVgR转录水平再次上升,至羽化后16 d达到最高水平。组织定位结果显示,NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性高表达,而在雌成虫脂肪体和肠道中微量表达,在雌成虫脑及雄成虫中均未检测到表达。【结论】NcVgR在黑尾叶蝉雌成虫卵巢中特异性表达,并且不同发育时期具有不同的表达量,这为研究黑尾叶蝉的生殖调控机理提供了分子信息。     

番茄潜叶蛾卵黄原蛋白受体基因TaVgR在生殖发育调控中的作用

【目的】本研究旨在明确卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor, VgR)在番茄潜叶蛾Tutaabsoluta生殖发育过程中的功能,为潜叶类害虫的绿色防控提供候选靶标。【方法】基于番茄潜叶蛾转录组数据,采用RT-PCR扩增TaVgR基因cDNA全序列,并进行生物信息分析;通过RT-qPCR分析TaVgR在番茄潜叶蛾不同发育阶段(1-4龄幼虫、1-7日龄雌蛹和雌成虫)和雌成虫不同组织(头、体壁、前肠、中肠、后肠、卵巢、脂肪体和马氏管)中的表达模式;进一步利用RNAi抑制番茄潜叶蛾雌蛹体内TaVgR的表达,并观测沉默TaVgR基因后番茄潜叶蛾卵巢发育及繁殖力的变化。【结果】克隆获得番茄潜叶蛾TaVgRcDNA(GenBank登录号: MZ682118)序列,其开放阅读框序列长5 496 bp,编码1 831个氨基酸,推测的蛋白分子量约为206 kD,等电点为5.17,信号肽包含N-端前18个氨基酸残基,并具有典型LDLR家族蛋白保守功能域。RT-qPCR结果显示,TaVgR转录水平随着番茄潜叶蛾龄期的增加逐渐上升,雌成虫羽化后达到最高水平;TaVgR在番茄潜叶蛾雌成虫的卵巢中表达量最高。TaVgR RNAi对初期雌蛹中TaVgR的表达抑制率为62.04%~72.55%,导致卵黄蛋白在卵巢中的沉积受阻,卵巢管和卵粒长度缩短,成虫10日单雌总产卵量及后代卵孵化率降低,最终引起番茄潜叶蛾繁殖力下降。【结论】TaVgR基因在番茄潜叶蛾雌成虫和卵巢中高表达,且沉默该基因严重阻碍其卵巢发育和降低繁殖力。本研究为开发以VgR基因作为靶标的鳞翅目害虫防治新技术奠定了理论基础。     

蜜蜂卵黄原蛋白的作用

卵黄蛋白不仅为胚胎发生提供营养物质,它在生物体内还具有其他的生物学功能。昆虫卵黄蛋白是昆虫卵内的营养储备,它的前体主要来源于脂肪体的雌性特异血蛋白——卵黄原蛋白(Vg),它是近年来昆虫生理学和生化学最活跃的领域之一,文章介绍蜜蜂卵黄原蛋白在蜜蜂生殖过程中的作用,以及与蜜蜂社会性生活及寿命的关系。     

蓖麻蚕卵黄原蛋白cDNA的克隆及序列分析

本文论述了蓖麻蚕卵黄原蛋白cDNA迅速克隆化的方法,SDS－PAGE鉴定的蓖麻蚕卵黄原蛋白由大小二个亚基构成,求出的分子量大亚基为180kDa,小亚基为45kDa,从解析的蓖麻蚕卵黄原蛋白氨基酸序列推算的分子量大亚基为161．06kDa,小亚基为40．53kDa,如果考虑到翻译后的修饰,这与SDS－PAGE求出的分子量是吻合的。蓖麻蚕卵黄原蛋白cDNA是由5788pb构成,一个ORF为5337个碱基,编码了1779个氨基酸。在信号肽的15个氨基酸残基中,有12个是硫水性氨基酸残基。这与其他昆虫卵黄原蛋白信号肽区域的硫水性分析是一致的。蓖麻蚕卵黄原蛋白N-linked glycosylation site的分布与家蚕、柞蚕和天蚕不同,3处N-linked glycosylation site存在于大亚基里,2处地多聚丝氨酸区域上流的小亚基里。另外,我们发现在所解析的柞蚕、天蚕的蓖麻蚕卵黄原蛋白氨基酸序列的C－末端区域里DGQR、GICG功能部位及其后的6个半胱氨酸都完好地保存。     

半翅目昆虫卵黄原蛋白及其合成调控的研究进展

昆虫卵黄原蛋白（Vitellogenins, Vg）是一种多功能的生殖发育关键调控蛋白,在不同昆虫体内的结构、合成调控及功能不尽相同。随着基因编辑技术的成熟,运用分子手段调控Vg的合成,可减少卵黄发生,降低昆虫的繁殖力,成为有效防治害虫的优势方法之一。因此,Vg及其合成调控的研究受到广泛关注。半翅目害虫是农林业的重点防治对象之一,除直接刺吸为害寄主外,其常传播植物病原体,对农业生产造成了严重危害。半翅目昆虫Vg除在生殖发育中的关键作用外,还与病原菌的传播、寄主免疫等密切相关,可成为分子水平防治半翅目害虫及其继发病害的优势靶标。因此,本文总结了半翅目昆虫Vg的合成方式、合成场所,指明了其结构上蛋白亚基数目的差异,概述了其与昆虫免疫反应、植物防御、病毒传播等有关的研究进展,总结了其合成的保幼激素（包括保幼激素受体Methoprene-tolerant和转录因子Krüppel homolog 1等关键调控因子等）、蜕皮激素和胰岛素信号通路等主要的内分泌激素调控通路,以及以营养信号调控为主的非激素调控通路,为探索半翅目害虫的分子防控手段提供理论依据。     

天蚕卵黄原蛋白的合成、运转与沉积

系统测定了天蚕Antheraea yamamai吐丝结茧至成虫期脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄蛋白和可溶性蛋白总含量的动态变化。结果表明,脂肪体是卵黄原蛋白(Vg)合成场所,Vg合成始于吐丝结茧后第4天;脂肪体、血淋巴中Vg滴度在吐丝结茧后第4天开始上升,化蛹后第6天或第8天达高峰,成虫羽化第1天则明显下降。卵巢对Vg摄取始于化蛹第1天,此后随蛹日龄逐渐上升,并渐趋平稳。同一卵巢管中卵黄蛋白(Vt)含量自顶端至基端随卵室增大而逐渐升高,不同日龄蛹中相应序号卵室的Vt含量以日龄大者为高;卵室中Vt含量与卵室体积大小呈正线性关系。电镜观察表明,Vg被卵母细胞摄入后以卵黄体形式存在,不同发育阶段卵巢中卵母细胞内卵黄体大小不同,以早期者为小;同一卵巢管中不同卵母细胞内卵黄体以顶端为小,基端明显增大,且卵黄体呈网状。     

家蚕醛氧化酶基因（BmAOXs）的鉴定与表达分析

醛氧化酶（aldehyde oxidases, AO, EC 1.2.3.1）是属于钼-黄素酶（molybdo-flavoenzymes, MFEs）家族的一类蛋白酶。为了探讨该酶在家蚕Bombyx mori中的功能, 本研究对家蚕醛氧化酶基因（BmAOXs）家族进行了鉴定和分析。以其他物种AO基因序列检索家蚕全基因组数据库, 获得了8个BmAOX候选基因, 均具有醛氧化酶保守的功能域。进化分析表明, BmAOX与其他昆虫AO聚为一簇。RT-PCR分析结果显示: BmAOX1, BmAOX2, BmAOX3, BmAOX5具有很强的组织特异性; 而BmAOX4, BmAOX6, BmAOX7, BmAOX8则在蛹和成虫的多个组织中均有表达, 提示它们在家蚕生理代谢活动中起重要作用。利用Native PAGE和活性染色方法, 对BmAOX编码的蛋白进行检测, 结果表明: 家蚕蛹中有5种有活性的醛氧化酶, 而成虫中有6种, 各组织中均有有活性的BmAOX, 只是种类和活性水平有所不同。本研究结果为深入探讨BmAOX家族的功能奠定了基础。     

家蚕两种新的类鹑斑突变体的遗传分析和SSR标记定位

在家蚕品种选育过程中发现了两种斑纹突变体, 与普通斑相比, 其幼虫眼状纹不明显, 而半月纹和星状纹正常, 其间有点和线构成鹑状斑纹, 第6、7腹节背面布有纵向波纹状斑纹, 整体斑纹与鹑斑(quail,q)极其相似, 暂且命名为类鹑斑(quail-like, q-l)。其中一种突变体稚蚕期体色呈褐色, 蚕体发育正常, 蚕茧大小一致, 茧型正常, 称为褐色类鹑斑(brown quail-like, q-lb); 另一种突变体幼虫体色为浅粉紫色, 幼虫食桑量少, 发育缓慢, 体质较弱, 体型较小, 茧型偏小, 称为紫色类鹑斑(purple quail-like, q-lp)。遗传分析表明, 两个类鹑斑基因均为隐性基因; 褐色类鹑斑(q-lb)与紫色类鹑斑(q-lp) 为等位基因, 紫色类鹑斑(q-lp)对褐色类鹑斑(q-lb)为隐性。经与形态标记P3(2)、p(2)、Ze(3)、L(4)、re(5)、E(6)、q(7)、I-a(9)、ms(12)、ch(13)、oa(14)、cts(16)、mln(18)、 msn(19)、rb(21)、so(26)测验和SSR分子标记多态性分析, 新发现的两种类鹑斑不同于鹑斑(q), 其基因座位于第8连锁群。     

家蚕第12连锁群EST-SSR标记的筛选和分析

为了探究家蚕Bombyx mori EST-SSR标记的多态性, 对检索获得的家蚕第12连锁群的4 465条EST序列进行了分析, 整理和拼接后得到581条非冗余EST序列, 总长度约为480 kb。其中, 有122条序列中共检测到154个EST-SSR, 占所研究的EST序列的2.73%, 平均每3.12 kb 含有一个EST-SSR。在所检测的EST-SSR中, 三核苷酸和四核苷酸重复是主导类型, 分别占总数的36.36%和28.57%,大部分表现为Perfect形式; 核苷酸重复平均长度约为16.2 bp, 最长为30 bp。进一步进行同源性分析, 发现有26条序列可以在NCBI中检索到同源序列, 在这些序列中一共含有40个SSR, 其中14个(35.0%)位于5′-UTR, 11个(27.5%)位于3′-UTR, 15个(37.5%)位于CDS区。根据筛选到的微卫星序列设计11对引物, 其中8对引物有扩增产物, 且条带清晰; 应用引物ES1204对8个家蚕品种进行PCR扩增都呈现多态性。结果说明通过家蚕EST数据库发掘SSR标记是一条可行的途径。     

家蚕雌激素相关受体基因的克隆与表达分析

【目的】黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 雌激素相关受体（estrogen-related receptor, ERR）通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR 基因 (BmERR) 的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析, 并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆 BmERR 基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】BmERR 基因全长cDNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示BmERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量 RT-PCR 检测表明,BmERR 在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR cDNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。     

Identification and characterization of the diuretic hormone 31 receptor in the silkworm Bombyx mori

The receptor for diuretic hormone 31 (DH31R) was identified in the silkworm Bombyx mori. A heterologous expression system revealed that an orphan G-protein coupled receptor, BNGR-B1, responded to DH31 and upregulated the intracellular cAMP level. DH31R (BNGR-B1) was predominantly expressed in the anterior silk gland, midgut, and ovary, whereas DH31 was predominantly expressed in the central nervous system and midgut.     

Molecular characterization of the vitellogenin receptor from the tick,Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae)

We have identified the full-length cDNA encoding a vitellogenin receptor (VgR) from the African bont tick Amblyomma hebraeum Koch (1844). VgRs are members of the low-density lipoprotein receptor superfamily that promote the uptake of the yolk protein vitellogenin (Vg), from the haemolymph. The AhVgR (GenBank accession No. JX846592) is 5703 bp, and encodes an 1801 aa protein with a 196.5 kDa molecular mass following cleavage of a 22 aa signal peptide. Phylogenetic analysis indicates that AhVgR is highly similar to other tick VgRs. AhVgR is expressed in only the ovary of mated, engorged females, and is absent in all other female tissues and in both fed and unfed males. Unfed, adult females injected with a VgR-dsRNA probe to knock-down VgR expression experienced a significant delay in ovary development and started oviposition significantly later than controls. These results indicate that the expression of AhVgR is important for the uptake of Vg and subsequent maturation of the oocytes.     

Sperm-mediated gene transfer in the silkworm Bombyx mori

Plasmid DNA containing the CAT reporter gene was injected into the testis of V instar silkworm larvae. The persistence, expression, and transmission of the injected DNA were monitored in the injected individuals till eclosion as well as in the progeny. The DNA injected into the testis persisted extrachromosomally during the entire period of metamorphosis and was also transferred into the egg via sperm during fertilization. Injected plasmids were rescued from the moths that emerged from the injected larvae and also from the eggs laid by the moths that copulated with injected males. Positive signals for CAT assay in the experimental samples suggested that the injected DNA was internalized in the testicular cells and sperm. The persistence, expression, and transmission of the DNA injected into the testes indicate that sperm-mediated gene transfer is possible in the silkworm, Bombyx mori. Arch. Insect Biochem. Physiol. 37:168–177, 1998. © 1998 Wiley-Liss, Inc.     

家蚕二分浓核病毒感染家蚕后的释放动态研究

【目的】研究家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)感染家蚕后不同时间段内释放到环境中的病毒量,为通过蚕沙快速检测病毒提供方法和依据。【方法】选取家蚕二分浓核病毒基因组节段VD1上的ns1基因和VD2上的ns3基因中的一小部分片段,分别克隆到p MD18-T载体上,制备标准品质粒,并用实时荧光定量PCR的方法绘制ns1和ns3的标准曲线。通过检测Bm BDV感染5龄家蚕后不同时间蚕沙中的病毒量来衡量释放到环境中的病毒的变化动态。【结果】在病毒感染家蚕第3天,大量的病毒随蚕沙释放到环境中,每微克蚕沙中约含1.38×106个VD1,6.54×105个VD2;从感染后第5天开始,释放到环境中的病毒量呈指数型增加;第7-8天病毒的释放量到达一个平台期,此时每微克蚕沙中约有2.12×107个VD1,1.34×107个VD2。普通PCR结果也反应出了类似的病毒释放动态。【结论】根据Bm BDV感染家蚕后的释放动态,推测病毒的复制周期约60 h。利用实时荧光定量PCR检测蚕沙中的Bm BDV,能简单、快速、准确地诊断病毒的感染。     

家蚕化学诱变剂及诱导突变体的筛选

在家蚕Bombyx mori基因组计划完成之后,其功能基因组研究成为该领域的最重要课题。突变体是功能基因组学研究的重要材料,因此,通过人为诱导获取大量的突变系统是及其重要的手段。本研究用化学诱变剂ENU、MNU、DES、5-BU、EMS诱导处理家蚕标准品种C108,筛选获得了非滞育红卵,长圆筒茧、小茧、丝胶茧及绵茧突变体,致死突变体及无鳞毛蛾翅突变体。结果还表明： MNU、DES诱变家蚕的突变效率高,注射翅原基比腹部更方便且效果好,化学诱导雄体比雌体的效果好; 在时期上,注射蛹和蛾都有诱导效果。上述突变体大多为致死性突变,推测其可能与致死性基因突变有关。同时,本研究为应用TILLING技术鉴定家蚕更多目的基因突变体提供了有效的材料。