微生物发酵法生产L-赖氨酸的研究进展

微生物发酵法是目前生产L-赖氨酸最主要的方法。L-赖氨酸生物合成存在两个完全不同的途径：二氨基庚二酸途径和a-氨基己二酸途径;分别由不同的酶进行调节,控制L-赖氨酸的合成。笔者概述了L-赖氨酸生产方法、生物合成途径以及合成中关键性酶的调节作用和国内外L-赖氨酸生产菌育种方法的研究进展。     

有益芽胞杆菌受体菌研究

采用酸性茚三酮法测定了30株有益芽胞杆菌的赖氨酸产量,然后在不同的溶菌酶浓度下,对赖氨酸产量超过0.07g/L的21株菌进行原生质体转化质粒pUB110,测定原生质体形成率、原生质体再生率及转化频率,结果6103,6104,6120,6129四株菌的转化频率较高。然后,采用经典遗传学方法选育AEC抗性突变株,使赖氨酸积累提高。其中,B. licheniformis 6104诱变菌株610401能积累赖氨酸2.91 g/L,比出发菌株提高了17倍左右,转化率也提高了一个数量级。通过质粒的再转化试验及传代稳定性试验,进一步证实B.licheniformis 6104及其突变菌株610401是较好的受体菌,尤其是用于赖氨酸合成酶基因的表达。     

L—赖氨酸高产菌株选育的研究

L-赖氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Corynebacteriumcrenatum）N30－25菌株经紫外线诱变处理,分别在含有不同浓度的七叶苷的培养基上进行筛选,经摇瓶多次复筛获得了3株高产变异菌株。对这3株菌在相同发酵条件下进行发酵生产L－赖氨酸,与出发菌株比较,产量提高了22－31％,经过3次传代,产生L－赖氨酸能力仍很稳定。     

有益芽孢杆菌受体菌研究

采用酸性茚三酮法测定了30株有益芽胞杆菌的赖氨酸产量,然后在不同的溶菌酶浓度下,对赖氨酸产量超过0．07g/L的21株菌进行原生质体转化质粒pUB110,测定原生质体形成率、原生质体再生率及转化频率,结果6103,6104,6120,6129四株菌的转化频率较高。最后,采用经典遗传学方法选育AEC抗性突变株,使赖氨酸积累提高。其中,B.licheniformis 6104诱变菌株610401能积累赖氨酸2．91g/L ,比出发菌株提高了17倍左右,转化率也提高了一个数量级。通过质粒的再转化试验及传代稳定性试验,进一步证实B.licheniformis 6104及其 突变菌株610401是较好的受体菌,尤其是用于赖氨酸合成酶基因的表达。     

草鱼生长阶段对赖氨酸需要量的研究

采用生长研究法来确定约草鱼的赖氨酸需要量,并对血清、肌肉和肝脏的游离赖氨酸迸行了检测.结果表明,按生长率最大值所确定的幼草鱼赖氨酸需要量为饲料中的1.611%按血清游离赖氨酸浓度最大值所确定的赖氨酸需要量为饲料的1.28%,明显低于生长研究法确定的结果.用肝脏和肌肉游离赖氨酸浓度为指标确定的赖氨酸需要量分别为饲料的1.46%和1.49%,这与生长研究法确定的赖氨酸需要量较接近.     

产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶的异源表达及粗酶性质

赖氨酸脱羧酶,可以催化赖氨酸脱羧生成戊二胺。戊二胺是重要的平台化合物,可以合成新型聚酰胺材料、脂肪族异氰酸酯等新材料。本研究对来自于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶进行异源表达。以pUC18质粒为载体,将来源于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶基因ldc克隆到大肠杆菌,得到菌株LN18。在添加0.5 mmol/L IPTG的LB培养基中,对LN18进行摇瓶培养,发酵液酶活可达到35 U/g发酵液,从发酵液制备的赖氨酸脱羧酶粗酶蛋白的酶活可以达到30 000 U/g粗蛋白。产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧粗酶蛋白大小约80 kDa,粗酶的最适温度和pH值分别为55℃和5.5,与文献中报道的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶Cad A在pH 8.0几乎没有酶活不同,产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶在pH 8.0的酶活达到最优pH下酶活的30%以上。金属离子对酶活有一定的影响,Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)有一定的抑制作用。     

NADPH缺陷型Corynebacterium glutamicum重组菌株的构建及其性能分析

[目的]改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中NADPH合成途径,阻断胞内NADPH的合成,获得1株NADPH营养缺陷型菌株。[方法]通过失活L-赖氨酸高产菌C. glutamicum Lys-χ中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)和苹果酸酶(MalE)并将NADP~+依赖型异柠檬酸脱氢酶(NADP~+-Icdcg)替换成变形链球菌(Streptococcus mutans)中的NAD~+-Icdsm,阻断胞内NADPH的合成。随后结合辅因子工程,引入大肠杆菌(Escherichia coli)中膜结合吡啶核苷酸转氢酶(PntAB)并通过不同强度启动子控制PntAB的表达水平。最后,分析不同重组菌中胞内氧化还原水平和L-赖氨酸生产强度的变化。[结果]重组菌C.glutamicum Lys-χΔZMI_(Cg)::I_(Sm)(即Lys-x1)胞内检测不到NADPH,为1株NADPH营养缺陷型菌株。该重组菌只在以葡萄糖酸为碳源的基础培养基中生长和积累L-赖氨酸,而以葡萄糖、丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸为碳源时无法生长。此外,表达E.coli中的PntAB可回补重组菌Lys-χ1胞内NADPH的水平,但由于不同强度启动子控制PntAB表达水平不同,重组菌胞内NADPH水平也不同,并影响L-赖氨酸的生产强度。[结论]重组菌Lys-χ1可作为有效的底盘细胞,用于考察不同的NADPH再生策略,获得不同胞内NADPH水平的重组菌株,为进一步阐明NADPH调控微生物细胞生理代谢功能的机制提供研究基础。     

乳酸发酵短杆菌 (Brevibacterium lactofermentum)氟丙酮酸敏感突变型赖氨酸的生产

<正> 从乳酸发酵短杆菌AJ3990诱发产生的FP—敏感突变型中可以选得较高赖氨酸产量的菌株。洗涤细胞在FP及生物素共存时,可以协同刺激赖氨酸的生成。FP分别在0.04mM和1 mM浓度时,可以抑制AJ3990 50%细胞生长及PDH的活力。因此,FP及过量的生物素对于赖氨酸的生物合成的协同效应似乎是由于PDH/PC活力比例的最优化造成的。这可以通过选择FP—敏感突变型,并从中得到具有赖氨酸合成最佳的PDH活力菌种而证实。赖氨酸生产菌产量最高菌种,AJ11204,经比较,仅为亲本AJ3990PDH活力的27%。它在过量生物素存在时,产生70克/升赖氨酸及从葡萄糖50%转化率。     

用基因组重排技术选育赖氨酸高产菌株

摘要：【目的】以北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）1为研究对象,选育赖氨酸高产菌株,并探索赖氨酸产生菌基因组重排育种的基本规律。【方法】利用基因组重排技术选育赖氨酸高产菌株。【结果】通过四轮基因组重排成功选育出了5株遗传稳定的高产赖氨酸菌株,其中1株重排菌株赖氨酸产量达到16.95 g/dL,比原始菌株Corynebacterium pekinense 1赖氨酸产量提高了37.14%,比亲本菌株赖氨酸产量提高了17.46％~31.19%。【结论】首次采用基因组重排技术改良赖氨酸产生菌,成功选育出了5株产量较稳定的高产赖氨酸菌株,具有潜在的应用价值。     

赖氨酸流加发酵最优控制的研究

在赖氨酸发酵动力学模型和庞特里金明小值原理的基础上,得出流加发酵的最优化底物流加方式。并进一步对流加发酵的全过程进行了分析,得出了在实际控制中较为可行的流加发酵全过程的总控制策略,实际控制表明在小型反应器中赖氨酸产生菌FB42的发酵水平为81．6g／l。、转化率为0．418％、生产强度为1．16g／h·L,和分批发酵相比分别提高了45．4％、9．7％和28．4％。     

赖氨酸在嗜热自养型甲醇IS株中籍二氨基庚二酸途径的生物合成

<正> 嗜热自养型甲醇菌是一种原细菌具有赖氨酸生物合成之二氨基庚二酸途径中的第一和最后一个酶,即二氢吡啶二羧酸合成酶与二氨基庚二酸脱羧酶,这种菌没有酵母氦酸脱氨酶,即赖氨酸的氨基已二酸生物合成途径的最后一个酶,二氢二吡啶二羧骏合成酶被赖氨酸抑制,但不受其阻遏。我们认为这种细菌是以二氨基庚二酸途径来合成赖氨酸的。     

提高赖氨酸生产的途径

赖氨酸是八大必需氨基酸之一,在食品工业、医药工业、饲料工业以及人的保健事业中已得到广泛应用。据1981年的统计,全世界生产赖氨酸将近四万吨;90％用于饲料添加剂。日本的赖氨酸生产居首位,占整个赖氨酸生产的60％,而80％以上的赖氨酸制品销售国外。目前,我国也已重视赖氨酸产生菌及其生产的研究,并把赖     

小麦纹枯病菌氮素营养的研究

研究了培养基中硫酸铵、亚硝酸钠、尿素、酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨 酸、亮氨酸、组氨酸、胱氨酸和脯氨酸等 １２种氮源对小麦纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｃｅｒｅａｌｉｓ）生 长的影响．结果表明,对小麦纹枯病菌生长最适宜的氨基酸是亮氨酸和脯氨酸,对铵盐、亚 硝酸盐和硝酸盐均能有效利用,对胱氨酸和赖氨酸利用能力最差．最后对小麦纹枯病菌的 Ｎ素营养与病害的发展和小麦植株营养状态之间的关系进行了讨论．     

氧代赖氨酸抗真菌作用机制的初步研究

氧代赖氨酸对致病真菌类秃发念珠菌的ＭＩＣ为０．８－３．１μｇ／ｍｌ,而两性霉素Ｂ为１．６－３．１μｇ／ｍｌ．氧代赖氨酸高于赖氨酸１０倍浓度,无明显抑制白含珠菌对Ｌｙｓｉｎｅ的吸收。Ｏｘａｌｙｓｉｎｅ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ对白色念珠菌细胞膜透性,如胞内物于ＵＶ２６０ｎｍ下的吸收物质外泄无明显影响。放射性前体物渗入试验结果指出,Ｏｘａｌｙｓｉｎｅ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ弱抑制（＾１４Ｃ）－Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎ和（     

赖氨酸酰化酶的重组表达及其催化合成ε-月桂酰-L-赖氨酸

来源于链霉菌的赖氨酸酰化酶Sm-ELA能催化赖氨酸和月桂酸在水相中合成月桂酰赖氨酸,避免了采用化学合成法所必需的高温和有机溶剂条件,是一种节能、环境友好的替代方法。构建了过表达链霉菌赖氨酸酰化酶基因的重组质粒pET28a-SmELA和pTrcOmpXK₁₂₂SmELA,分别实现了该酶在大肠杆菌胞内和细胞表面的活性表达。比较两种不同表达方式的效果后,将重组酶应用于催化合成月桂酰赖氨酸的反应中,结果显示,在赖氨酸浓度为50 mmol/L,月桂酸浓度为10 mmol/L时,反应24 h,月桂酸转化率最高达到31.1%。     

L-赖氨酸高产菌的选育及发酵培养基的优化

目的:获得L-赖氨酸高产菌及得到最优的发酵培养基.方法:以黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum)XQ-8为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)逐级诱变处理,在发酵培养基中添加乙酸和乙醇,在发酵过程中添加吐温-80和二甲基亚砜.结果:获得一株L-赖氨酸高产菌XQ-89(SGгVal-),摇瓶发酵72h赖氨酸产量达到77g/L,对乙酸、吐温-80和玉米浆三因素利用响应面分析法(Response Surface Methodology)对其添加量进行优化.当乙酸、吐温-80及玉米浆的添加量分别为0.32%、0.66%、1.5%时赖氨酸达到94g/L,比优化前提高22.1%.结论:筛选的(SGгVal-)标记是有利于L-赖氨酸的积累,添加乙酸和吐温-80对提高L-赖氨酸的产量是有效的.     

谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶G359D突变解除赖氨酸与苏氨酸协同抑制的研究

天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase,AK)是赖氨酸合成途径中关键酶,其受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,旨在发现其解除协同抑制的新突变体并解析其机理。通过对赖氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum ZL5与野生型C.glutamicumATCC 13032的天冬氨酸激酶氨基酸序列比对,发现在高产菌的天冬氨酸激酶中存在G359D突变。通过体外天冬氨酸激酶野生型和G359D突变体酶活检测,发现该G359D突变体在10 mmol/L赖氨酸和苏氨酸同时存在时仍保留了76.94%±1.61%的酶活,而野生酶的酶活仅残留4.38%±1.28%。这一结果在赖氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌的回复突变中也可得到验证,其回复突变后使赖氨酸产量下降15.57%。通过同源建模和结构分析发现,与野生酶相比,G359D突变体结合赖氨酸后,其位于活性中心附近的Arg151与Glu74之间无法形成离子键,允许底物分子的结合而具有较高活性。发现天冬氨酸激酶G359D突变体可阻断赖氨酸引起的别构效应,从而有效解除赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。     

激素对提高赖氨酸发酵单位的影响

添加4种不同浓度的赤霉素和三十烷醇对赖氨酸发酵进行了摇瓶试验。结果表明:在添加适当浓度的激素时,对提高赖氨酸发酵单位有一定促进作用。     

北京棒状杆菌AS1.563发酵生产L-赖氨酸研究的扩大试验

L-赖氨酸是一种人体必需的氨基酸,国外已应用于食品、饲料、医药等方面。本文主要介绍AS 1.563菌发酵生产L-赖氨酸研究的扩大试验结果。     

一株AEC^hrL—赖氨酸产生菌

从乳糖发酵短杆菌Brevibacterium Lactofermentum2645菌株出发选育L-赖氨酸产生菌,经分离复壮后,用硫酸二乙酯(DES)诱变处理,由添加S-(2-氨基乙基)—L—半胱氨酸(AEC)和L-苏氨酸的药物平板定向筛选,最后获得了一株L—赖氨酸高产菌E_(16-2)(AHV~(hr)SAM~gAEC~(hr))。进而通过正交试验、工艺条件试验最终获得了该菌株的最佳发酵条件,并考查了在此条件下的L-赖氨酸发酵过程,结果表明该菌具有生长、耗糖、产酸速度快、发酵周期短的明显特点。