宁海地区香鱼弧菌病病原菌鉴定

摘要：【目的】香鱼弧菌病对中国沿海地区的香鱼养殖业造成了巨大的危害,然而,病原不明导致了防治上的许多问题。本文鉴定了引起宁海地区香鱼爆发性弧菌病的病原。【方法】采用TCBS平板分离优势菌;采用回归感染试验确认病原菌,采用改进的寇氏法计算LD50;采用形态学观察、生理生化特征测定、细菌特异性引物PCR扩增检测及细菌16S rRNA和金属蛋白酶（MP）基因序列分析鉴定细菌;采用药敏实验测定它对部分抗生素的敏感性。【结果】分离并鉴定优势菌株ayu-H080701为宁海地区香鱼弧菌病的病原菌,它对香鱼的半致死量为1.2×104 CFU。形态学观察和生理生化特征测定表明,ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌最为接近。PCR扩增检测表明,细菌16S rRNA 基因通用引物和鳗利斯顿氏菌MP基因特异引物均能扩增到预期大小的特异性条带。ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌16S rRNA基因核苷酸序列同源性最高,为99.4%～99.5%,与同属的海弧菌和美人鱼发光杆菌分别为94.3%和91.9%;ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌MP氨基酸序列同源性高达97.6%～98.8 %,与其它弧菌科成员则低于75.6 %,系统进化树分析也揭示ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌进化相关性最高。【结论】引起宁海地区香鱼弧菌病的菌株ayu-H080701被鉴定为鳗利斯顿氏菌。     

涅斯捷连科氏菌属菌株的分离及系统学研究

从我国新疆及埃及东部高盐环境中分离到 4株形态上类似于涅斯捷连科氏菌属的革兰氏阳性菌株。以该属的 2个典型菌株 (NesterenkoniahalobiaDSM 2 0 5 4 1T和NesterenkonialacusekhoensisDSM 12 5 4 4 T)为对照 ,对 4个分离菌株进行了包括形态学 ,生长pH范围 ,温度范围 ,耐NaCl,KCl,MgCl2 ·6H2 O ,CaCl2 实验及酶学特性以及细胞化学组份、(G C)mol%含量测定 ,16SrDNA分析及DNA DNA杂交在内的多相分类研究。结果显示 ,4个分离菌株属于涅斯捷连科氏菌属 ,但与涅斯捷连科氏菌属的 2个有效发表种有显著差异 ,因此 4个分离菌株均为该属的新种     

16S rRNA PCR鉴定嗜酸乳杆菌鸡源分离株

用自行设计的嗜酸乳杆菌16S rRNA的特异性引物和建立的PCR方法对初步鉴定为嗜酸乳杆菌的鸡源分离株进行检测。PCR检测结果表明分离株和嗜酸乳杆菌参考株扩增出大小一致的目的片段,从分子水平对鸡源分离菌进行了鉴定。     

利用16S rDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌

鸭疫里默氏菌感染是危害养鸭业的主要疾病,用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足,因此有必要建立检测该菌的种特异性PCR法。利用已登录的鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的16S rDNA基因序列,设计了一对鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的特异性引物190f和843r,分别以基因组DNA和菌落提取液为模板,从1~19型鸭疫里默氏菌参考菌株和代表亚型、变异株和可能新型的国内分离株共26株细菌中均扩增出大小为654bp的特异性片段,而扩增鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌等感染鸭的常见细菌的结果均呈阴性。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释,基因组DNA的最小检出量为50pg,菌落最小检出量为15CFU/mL。结果说明,该PCR法具有较好的特异性和敏感性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏菌。     

乳及乳制品中肺炎克雷伯氏菌PCR-DHPLC检测新技术的建立

为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立乳品中肺炎克雷伯氏菌的快速检测方法,根据肺炎克雷伯氏菌16S-23S rRNA特异基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以肺炎克雷伯氏菌等57株参考菌株做特异性试验;将肺炎克雷伯氏菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度试验。试验结果表明该方法具有很好的特异性,灵敏度较高,检测低限可达到100 CFU/mL,可以快速、准确检测肺炎克雷伯氏菌,是乳及乳制品中致病菌快速检测的新技术。     

属特异性T-RFLP技术用于乳酸杆菌的群落分析

【目的】设计乳酸杆菌属特异性T-RFLP技术(末端限制性片段长度多态性分析)对14株乳酸杆菌进行分型。【方法】采用源于16S-23S rRNA基因间隔区序列的乳酸杆菌属特异性引物LAB-rev,乳酸杆菌的属特异性引物,6-FAM荧光标记后结合16S上游通用引物7f用于乳酸杆菌的PCR扩增。【结果】选取HaeⅢ和HhaⅠ进行限制性酶切,最后对酶切后的产物末端测序得到T-RFLP峰谱图,该图谱能够快速准确地对不同种的乳酸杆菌进行定性、定量的分析。【结论】实验成功搭建T-RFLP技术用于微生态环境中乳酸杆菌检测的平台,对于在功能性食品、乳酸饮料和药物对肠道微生态的影响及菌种鉴定等领域有重大意义。     

快速鉴定诺卡菌的多重聚合酶链反应的建立

为快速准确鉴定诺卡菌,首先设计针对诺卡菌rpoB、secA1、16S rRNA基因的引物,利用单重聚合酶链反应(PCR)和测序验证引物的特异度,建立多重PCR鉴定系统,在同一反应体系和条件下对44株诺卡菌标准株、44株临床分离株和7株对照株进行扩增。结果显示,利用单对引物对其中2株诺卡菌(标准株DSM43003、临床株CDC 51)进行扩增,出现的条带均为与目的片段长度一致的单一条带,经测序并经基本局部比对搜索工具(BLAST)验证扩增片段为目的基因。建立的多重PCR结果显示,44株诺卡菌标准株中有43株(97.7%)、44株临床分离株中有42株(95.5%)rpoB、secA1、16S rRNA这3条片段均显示,7株对照株均未显示条带。结果提示,本研究建立的多重PCR简单、快速、灵敏度高、特异度好,适用于诺卡菌的快速鉴定。     

利用16SrDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌

鸭疫里默氏菌感染是危害养鸭业的主要疾病,用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足,因此有必要建立检测该菌的种特异性PCR法。利用已登录的鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的16S rDNA基因序列,设计了一对鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的特异性引物190f和843r,分别以基因组DNA和菌落提取液为模板,从1-19型鸭疫里默氏菌参考菌株和代表亚型、变异株和可能新型的国内分离株共26株细菌中均扩增出大小为654bp的特异性片段,而扩增鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌等感染鸭的常见细菌的结果均呈阴性。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释,基因组DNA的最小检出量为50pg,菌落最小检出量为15CFU／mL。结果说明,该PCR法具有较好的特异性和敏感性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏菌。     

肺炎克雷伯菌的芯片式数字PCR检测方法的建立

[背景]条件致病菌肺炎克雷伯菌是医源性感染最重要的革兰氏阴性菌之一,目前对该病原菌的核酸检测方法存在费时费力、灵敏度低、准确性差等问题.[目的]建立基于芯片式数字PCR的肺炎克雷伯菌检测方法.[方法]依据肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过与实时荧光定量PCR的比较分析,确定...     

代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源Lactobacillus菌株

[目的]对分离自猪肠道的乳酸杆菌S1菌株进行鉴定,并比较该菌株与同种的001T菌株的基因差异.[方法]对S1菌株进行16S rRNA基因序列分析和种特异PCR检测,并且对S1菌株和Lactobacillus sobrius 001T进行代表性差异分析(Representational difference analysis,RDA).[结果]16S rRNA基因序列分析表明,与S1菌株最相似的已知菌为L.sobrius.变性梯度凝胶电泳分析显示,仔猪空、回肠细菌图谱中有一与S1菌株有相同迁移位置的优势条带,克隆、测序鉴定表明,与该条带相匹配的16S rRNA基因克隆(Clone S)的最相似已知菌也为L.sobrius.16S rRNA基因系统进化分析表明,S1菌株与Clone S和L.sobrius 16S rRNA基因序列同源性分别为99.8%和99.6%.L.sobrius特异性引物也可以扩增S1株菌的16S rRNA基因的特定片段.因此S1菌株可被确定为Lsobrius.RDA对菌株S1和同种的猪源L.sobrius 001T菌株的基因差异进行分析,未发现这两株菌的基因组差异.[结论]猪肠道乳杆酸菌S1菌株属于L.sobrius,其与猪源L sobrius 001T菌株为相似菌株.     

河北九莲城淖尔可培养放线菌多样性及抗菌活性筛选

【目的】勘探干涸的九莲城淖尔土壤放线菌多样性并进行活性筛选,以期发现药用微生物资源,为新抗生素的发现奠定基础。【方法】采用15种分离培养基,以稀释涂布法分离放线菌;根据分离菌株的16S rRNA基因序列同源性分析放线菌多样性;发酵液经乙酸乙酯萃取,菌丝体经丙酮浸提,获得提取浓缩物样品;样品通过纸片扩散法进行抗菌活性初筛;抗菌阳性菌株采用PCR技术进行Ⅰ型聚酮合酶(PKS I)KS域、Ⅱ型聚酮合酶(PKS II)KS域和非核糖体多肽合成酶(NRPS)A结构域抗生素生物合成基因的检测。【结果】从11份盐湖土壤样品中分离纯化到251株放线菌,其分布于放线菌纲的10个目15个科31个属,其中优势菌属为链霉菌属和拟诺卡氏菌属;251株放线菌中包括57株耐(嗜)盐放线菌,其优势菌属为拟诺卡氏菌属(22株)和涅斯捷连科氏菌属(15株)。基于16S r RNA基因序列的系统发育分析显示,菌株J11Y309为糖霉菌科潜在新属,菌株J12GA03为分枝杆菌科潜在新种。96株放线菌活性检测结果显示,56株至少对1株检定菌具有抗菌活性,阳性率为58.3%;56株有活性的放线菌中,47株至少含有1种抗生素生物合成基因,其中17株同时具有3种抗生素生物合成基因。【结论】干涸的九莲城淖尔土壤中含有较为丰富的药用放线菌资源,具有从中发现放线菌新物种和新抗生素的潜力。     

PCR-酶切技术快速鉴定军团菌

[目的]建立一种新型的军团菌鉴定方法,并探讨该法在鉴定环境水源和临床标本军团菌菌株中的应用价值.[方法]根据军团菌16S rRNA基因保守序列设计引物,以分离培养得到的可疑军团菌菌株作为模板,采用PCR法对模板扩增,并用限制性内切酶对PCR产物进行酶切分析,建立一种嗜肺军团菌及非嗜肺军团菌的鉴定方法.对16株嗜肺军团菌、22株非嗜肺军团菌及12株其他细菌标准菌株进行检测,验证该方法的可靠性,最后用该法检测广州地区分离的169株可疑军团菌菌株并进行基因测序.[结果]该PCR方法检测嗜肺军团菌及非嗜肺军团菌所有标准菌株均为阳性,非军团菌检测结果均为阴性;进一步的Hinf Ⅰ酶切分析可准确的区分嗜肺军团菌标准菌株;广州地区分离的169株可疑军团菌菌株经该法检测发现160株为军团菌,其中79株为嗜肺军团菌,与基因测序检测结果一致.[结论]PCR-酶切技术可快速、特异地检测军团菌及嗜肺军团菌,适用于环境水源和临床标本可疑军团菌菌株的检测.     

引物应用策略：基于2对古菌16S rRNA基因通用引物对环境样品古菌多样性分析

【目的】找到适宜的16S rRNA基因通用引物应用策略,应对复杂环境微生物多样性调查,尤其目前高速发展的高通量测序技术带来的巨大挑战。【方法】用Oligocheck软件分别将两对应试的古菌16S rRNA基因通用引物与RDP(Ribosomal database project)数据库中古菌16S rRNA基因序列进行匹配比对。用两对应试引物分别构建海洋沉积物样品的古菌16S rRNA基因文库。【结果】软件匹配结果显示引物f109/r958与目的基因的匹配程度高于引物f21/r958。该结果与古菌16S rRNA基因文库RFLP分析、古菌多样性指数分析结果相吻合。数据还表明,2对引物的综合文库能更好满足该沉积物样品的古菌多样性分析。【结论】选用与数据库中目的基因匹配性高的通用引物和多个引物的联合使用,可以有效提高环境样品微生物多样性调查的分辨率。     

New genus-specific primers for the PCR identification of novel isolates of the genus Streptomonospora

The halophilic actinomycete genus Streptomonospora, forming a distinct branch in the 16S rRNA gene phylogenetic tree adjacent to the genera Nocardiopsis and Thermobifida, was first proposed by Cui et al. to accommodate the species type Streptomonospora salina. During a biodiversity and taxonomic study on halophilic filamentous actinomycetes from a saline lake in western China, numerous new halophilic actinomycetes strains were isolated. To confirm whether they are members of the genus Streptomonospora, one set of genus-specific oligonucleotides was designed which allows rapid detection of members of the genus Streptomonospora by means of PCR amplification. The genus specificity of these primers was validated with reference strains as well as with wild-type isolates, which exhibited morphological characteristics common to this genus.     

Characterisation of micromonosporae from aquatic environments using molecular taxonomic methods

Large numbers of strains assigned to the genus Micromonospora on the basis of typical colonial and pigmentation features were isolated from diverse aquatic sediments using a standard selective isolation procedure. Two hundred and six isolates and eight representatives of the genus Micromonospora were assigned to 24 multimembered groups based on a numerical analysis of banding patterns generated using BOX and ERIC primers. Representatives of multimembered groups encompassing isolated micromonosporae were the subject of 16S rRNA gene sequencing analyses. Good congruence was found between the molecular fingerprinting and 16S rRNA sequence data indicating that the groups based upon the former are taxonomically meaningful. Nearly all of the isolates that were chosen for the 16S rRNA gene sequencing analyses showed that the ecosystems studied are a rich source of novel micromonosporae. These findings have implications for high throughput screening for novel micromonosporae as BOX and ERIC fingerprinting, which is rapid and reproducible, can be applied as a robust dereplication procedure to indicate which environmental isolates have been cultured previously.     

中国典型冻土区土壤可培养细菌多样性

[目的]对比分析中国典型高纬度冻土区和高海拔冻土区土壤可培养细菌的多样性.[方法]采用NM、TSA 、R2A 3种培养基分离培养不同冻土区土壤可培养细菌,用通用引物扩增分离的细菌16S rRNA基因,根据系统发育分析进行鉴定.[结果]从6个样品中得到冻土土壤可培养细菌的菌落数量为4.70×103 -2.57×105 cfu/g(土壤干重),根据不同的菌落形态分离出144株可培养细菌.纯培养物的16S rRNA基因部分序列分析表明:我国高纬度冻土区土壤样品中的细菌分别属于Firmicutes分支(59.52％)、Gammaproteobacteria 分支(38.10％)、Betaproteobacteria分支(2.38％),其中假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)的菌株为该区域的三大优势菌群.我国高海拔冻土区土壤样品中分离细菌属于Gammaproteobacteria分支(89.22％)、Firmicutes分支(8.82％)和Bacteroidetes分支(1.96％)o优势菌群为假单胞菌属( Pseudomonas).[结论]我国高纬度冻土区和高海拔冻土区土壤具有较高的可培养细菌多样性;不同类型冻土区土壤可培养细菌群落组成不同.本文研究结果将为我国冻土区土壤细菌资源研究与利用提供理论依据.     

九香虫(椿象)体内可培养细菌的多样性分析

【目的】认识药用昆虫九香虫(Aspongopus chinesis Dallas)成虫体内可培养细菌资源多样性。【方法】运用纯培养法、反转录重复因子扩增(BOXA1R-PCR)分析技术、16S r RNA基因测序和系统发育分析对样品中可培养细菌进行多样性研究,测定了分离菌株的抗菌特性、吲哚乙酸(IAA)含量和产淀粉酶活性等指标。【结果】通过6种不同培养基共分离得到52株菌落特征不同的细菌菌株。基于菌落特征和BOXA1R-PCR图谱选取12株代表菌株用于16S r RNA基因序列测定。16S r RNA基因序列系统发育分析显示,52株菌株分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)4个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。分离到的52株细菌有44株(占总分离菌株的84.6%)表现出对供试病原菌具有较好的抑制作用,高达94.2%的分离菌株能产IAA,有43株(占总分离菌株的82.7%)表现出淀粉酶活性。【结论】九香虫内细菌种群较为多样,具有潜在应用价值。     

嗜酸丝状放线菌的选择性分离与多样性

摘要:【目的】针对酸性土壤中的嗜酸丝状放线菌,建立有效的选择性分离方法,并了解其多样性。【方法】用不同的样品预处理方式和分离培养基,并添加不同的抑制剂进行分离;根据放线菌的菌落数和出菌率确定最佳分离方法组合。采用最佳分离方法对从江西采集的17份酸性土壤样品进行分离;根据培养特征对分离菌株进行分群,进一步通过对各类群的显微形态观察和pH梯度生长实验确定代表菌株;对代表菌株进行16S rRNA基因序列分析研究其多样性。【结果】嗜酸丝状放线菌的最佳分离方法为：土壤样品经分散差速离心预处理后,涂布添加了放线菌酮、制霉菌素和萘啶酮酸（各50 mg/L）的GTV培养基。用此方法共分离到放线菌369株,归为10个不同的颜色类群,其中6.6%为严格嗜酸放线菌,72.4%为中度嗜酸放线菌,21.0%为耐酸放线菌。52株嗜酸放线菌代表菌株分布于放线菌目中的12个属：链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora) 、诺卡氏菌属(Nocardia)、野野村菌属(Nonomuraea) 、韩国生工属(Kribbella) 、小双孢菌属(Microbispora)、马杜拉菌属(Actinomadura)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)、指孢囊菌属(Dactylosporangium)、伦茨氏菌属(Lentzea)、游动四孢菌属(Planotetraspora) 和链嗜酸菌属(Streptacidiphilus),其中链霉菌分离菌株在系统发育树上形成12个不同的进化类群。【结论】所建立的选择性分离方法可用于土壤嗜酸丝状放线菌的高效分离;江西酸性土壤含有丰富多样的嗜酸丝状放线菌种属。     

贝壳砂改良土壤中反硝化细菌的分析

【目的】通过对一处经过长期使用贝壳砂进行改良的土壤中的反硝化细菌的多样性和细菌分离分析,研究该土壤中反硝化细菌的组成特征。【方法】采用454焦磷酸测序的方法分析了土壤样品中微生物群落的组成,选用Giltay培养基培养、鉴定从土壤中挑选的分离物的反硝化能力,并对具有反硝化能力的微生物进行了16S rRNA基因鉴定。【结果】该土壤样品中占据优势地位的为Proteobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi等门的微生物,属的水平上则有近70%尚未确立分类地位。所分离的细菌中,共得到12株厌氧条件下具有较高硝酸盐去除效率的微生物,分属Pseudomonas、Aeromonas、Serratia和Acinetobacter,均为γ变形菌纲的微生物。【结论】该土壤中具有较高的微生物多样性,包括很多未知类型的微生物和众多类型的反硝化细菌;分离到了11株具有反硝化能力的菌株,可用于该土壤的反硝化过程的进一步研究。