重组鼠疫菌F1抗原的纯化及其在ELISA检测鼠疫免疫中的应用

从表达rF1抗原的大肠杆菌中以Superdex-200凝胶过滤层析纯化rF1抗原,电泳扫描显示纯化率>90%。SDS-PAGE及琼脂免疫双扩散结果显示纯化的rF1抗原具天然F1抗原的活性。将此纯化的rF1抗原用于间接ELISA分析免疫动物血清中抗F1抗体的水平,并与天然F1抗原相比较,证明rF1抗原优于天然F1抗原分析结果,可用于鼠疫的血清学检测。     

鼠疫耶尔森菌F1抗原的性质研究

鼠疫菌F1抗原是鼠疫亚单位新疫苗最重要的候选抗原,对其性质的充分认识,将有助于抗原制造工艺和新疫苗的开发。F1抗原的性质研究包括:微观结构,一级核苷酸、氨基酸序列,二级结构,高分子聚集形态,以及F1抗原的理化性质。     

鼠疫菌F1抗体/抗原酶联免疫诊断试剂盒的应用评价

目的对兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒进行临床应用评价。方法采用双抗原/抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血球凝集试验(IHA)、胶体金免疫层析试验(GICA)3种方法的诊断试剂对比检测云南省地方病防治所中心实验室保藏的和现场采集的血清样品和脏器样品,对血清样品做鼠疫菌F1抗体检测,对脏器样品做鼠疫菌F1抗原检测。结果在358份血清样品中,ELISA试剂检出F1抗体阳性52份(14.52%),IHA试剂检出阳性37份(10.34%),GICA试剂检出阳性45份(12.57%)。ELISA与IHA试剂的符合率为95.23%,与GICA试剂的符合率为96.92%。经统计学χ2检验,ELISA试剂检出F1抗体阳性率高于IHA试剂(χ2=11.53,P=0.000 7),与GICA试剂检出的差异无统计学意义(χ2=3.27,P=0.070 4)。进一步分析滴度差值频数,ELISA试剂检测人血清的敏感性高于IHA试剂的样品占87.5%。在117份脏器样品中,3种试剂均检出F1抗原阳性15份(12.82%),符合率100%。滴度差值频数比较,ELISA试剂检测敏感性高于反向间接血球凝集试验(RIHA)试剂的样品为78.57%。结论兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒性质特异,其敏感性优于IHA试剂盒和GICA试剂条,值得在鼠疫的监测和快速诊断中推广应用。     

鼠疫菌V抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

从鼠疫杆菌野毒株总DNA中利用PCR方法扩增出V抗原编码基因,将此基因克隆到大肠杆菌的表达质粒pET42b(+)中,经IPTG诱导后,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功地表达出鼠疫菌V抗原蛋白。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的32.8%。     

无标签鼠疫耶尔森菌V抗原突变体在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的：在大肠杆菌中表达、纯化无标签鼠疫耶尔森菌低钙反应Ｖ抗原突变体,并对其免疫原性进行研究。方法：采用融合ＰＣＲ方法将Ｖ抗原基因中编码半胱氨酸的碱基缺失突变,将获得得Ｖ抗原突变体基因克隆到原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）后转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导表达并进行柱层析纯化,纯化产物以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹进行鉴定并免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,通过ＥＬＩＳＡ检测免疫血清效价。结果：目的蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性高表达,经三步柱层析后纯度高于９５％,经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测可与野生型Ｖ抗原单克隆抗体特异性结合,免疫小鼠后获得高效价免疫血清。结论：获得了无标签的鼠疫耶尔森菌Ｖ抗原突变体蛋白,并证实其具有免疫原性,将对Ｖ抗原结构和功能的研究提供帮助。     

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.     

无标签鼠疫耶尔森菌Ⅴ抗原突变体在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的:在大肠杆菌中表达、纯化无标签鼠疫耶尔森菌低钙反应V抗原突变体,并对其免疫原性进行研究。方法:采用融合PCR方法将Ⅴ抗原基因中编码半胱氨酸的碱基缺失突变,将获得得Ⅴ抗原突变体基因克隆到原核表达载体pET32a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并进行柱层析纯化,纯化产物以Western印迹进行鉴定并免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫血清效价。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性高表达,经三步柱层析后纯度高于95%,经Western印迹检测可与野生型V抗原单克隆抗体特异性结合,免疫小鼠后获得高效价免疫血清。结论:获得了无标签的鼠疫耶尔森菌Ⅴ抗原突变体蛋白,并证实其具有免疫原性,将对V抗原结构和功能的研究提供帮助。     

抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体对小鼠的被动免疫保护作用

目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,再分别用不同剂量的鼠疫强毒菌攻击,通过小鼠的存活率和存活时间,判定F1单抗免疫小鼠被动保护其抵抗鼠疫强毒菌攻击的有效性和剂量相关性。结果在14 d的观察期内,在100.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组和25.0μg组小鼠的存活率分别为100%、83%、50%、50%和0%,平均存活时间分别为15.00 d、14.67 d、13.00 d、13.50 d和9.67 d;2D2单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组、25.0μg组小鼠的存活率分别为83%、50%、50%、33%和0%,平均存活时间分别为14.83 d、13.33 d、12.67 d、12.33 d和8.00 d。在10.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗50.0μg组、25.0μg组和12.5μg组小鼠的存活率分别为83%、83%和17%,平均存活时间分别为14.17 d、14.50 d、9.83 d;2D2单抗50.0μg组、25.0μg组、12.5μg组小鼠的存活率分别为100%、33%和33%,平均存活时间分别为15.00 d、12.33d和11.67 d。2.0 MLD和1.0 MLD攻击的未免疫对照组小鼠全部死亡,平均存活时间分别为6.1 d和6.7 d。F1抗原单抗的免疫剂量与小鼠的平均存活时间和存活率有比较明显的相关性(P<0.05)。结论用抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗被动免疫小鼠,在受到鼠疫强毒菌攻击时,对小鼠具有免疫保护作用。     

新型鼠疫疫苗F1抗原原液性质的研究

目的新型鼠疫疫苗包含鼠疫减毒菌EV株培养提取的天然F1抗原。研究生理氯化钠溶液中F1抗原的生物与理化性质、结构概况及聚合状态等特性,以期对F1抗原的制备、质量控制及其免疫原性研究提供理论依据。方法①过碘酸-希夫(PAS)染色法、糖蛋白碳水化合物估测试剂盒鉴定F1抗原是否为糖蛋白,蒽酮-硫酸法定量测定F1抗原中多糖含量,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术测定F1抗原单体相对分子质量并与理论值差异比对,间接证明F1抗原是否糖基化;②高效分子排阻色谱法联用多角度激光散射(HPSEC-MALLS)法研究保存于生理氯化钠溶液中F1抗原的天然聚集状态;③搜索GeneBank获得鼠疫菌F1抗原的核苷酸序列,经DNAStar软件翻译出氨基酸序列,并通过肽段覆盖率验证成熟F1抗原的氨基酸序列,以圆二色谱试验结合K2D2软件推测二级结构,MALDI-TOF-MS测定单体相对分子质量。结果①鉴定出F1抗原单体相对分子质量为15 500的蛋白质,不含有多糖成分;②F1抗原的相对分子质量分布范围在10~6～10~7之间,呈现聚集状态;③F1抗原由149个氨基酸组成,单体相对分子质量为15 500,F1抗原的二级结构以β-sheet为主。结论新型鼠疫疫苗中F1抗原为不含多糖成分的蛋白质,天然状态下F1抗原以高分子聚集态存在,F1抗原单体相对分子质量为15 500,抗原结构性质稳定,与理论结果一致。在制造、检定和免疫学研究中应参考F1抗原的这些特性。     

重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液性质研究

目的进行重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液二聚体含量及性质研究,确定LcrV原液的相关质控标准。方法在不同缓冲体系(0.85%NaCl(NS)、20 mmol/L PBS),不同蛋白浓度(2.0、1.5、1.0、0.5、0.1 mg/mL)及不同保存温度(4℃、-20℃、-70℃)条件下保存LcrV抗原,采用SDS-PAGE和HPSEC方法定期检测LcrV二聚体含量及纯度。将连续三批检定合格的LcrV抗原原液进行质谱相对分子质量测定、等电点测定、N末端氨基酸序列测定、圆二色(CD)谱、HPLC肽谱及氨基酸组成分析,研究LcrV抗原的相关性质。结果随着保存时间的延长LcrV抗原二聚体含量增加,低温保存时二聚体不易大量形成。在-20℃和-70℃条件下,NS保存的LcrV抗原比PBS体系保存稳定,而在4℃条件下NS保存的LcrV抗原容易降解。LcrV抗原高浓度保存容易发生聚合。LcrV抗原在低质量浓度(0.1 mg/mL)保存时免疫学活性明显下降。质谱检测到LcrV单体和二聚体共同存在,且与理论相对分子质量一致。LcrV原液检测等电点范围为4.6～6.3。N末端测序、CD谱、HPLC肽谱图及氨基酸组成分析与理论结果一致。结论 LcrV抗原原液保存条件确定为:NS体系,蛋白质量浓度1.0～2.0 mg/mL,-20℃以下冻存。制备的LcrV抗原各项检测结果与理论结果一致,抗原性质稳定。     

Identification of immunodominant epitope of F1 antigen of Yersinia pestis

The F1 antigen of Yersinia pestis has been identified as one of the major protective antigens of this bacterium. The present study aims to delineate major and minor antigenic sites of F1 antigen. Using algorithmic predictions, five peptide sequences (P1, P2, P3, P4 and P5) spanning the C-terminal region were identified and synthesized. Antibodies were generated in mice against the peptides, native F1 protein and polymerized F1 antigen using liposomes as mode of immunization. Cross-reactivity between F1 antigen and peptides was tested using both solid and solution phase assays. Similar assays were done with rabbit anti-F1 sera. Competitive inhibition assays using a different combination of antisera and competing antigen identified P2 peptide FFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTV (142-165) as the immunodominant sequence. The results indicate that this sequence appears to be exposed on the surface of F1 molecule. In a solid phase binding assay, P2 peptide was recognized even at high F1 antisera dilution. However, when antisera raised to different peptides were tested for binding to F1 antigen, antisera to P4 peptide showed maximal immunoreactivity. This implies more accessibility of this region during immobilization on solid surface. There was consistency in the results obtained for different strains of mice as well as for the rabbit antisera. Such a sequence of F1 antigen, which is recognized widely in animals of different genetic background, would be useful for diagnosis and subunit vaccine.     

鼠疫抗原LcrV在乳酸乳球菌中的表达与鉴定

目的以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)为载体,将鼠疫抗原LcrV基因导入乳酸乳球菌内,构建重组肠道微生态菌株,作为黏膜免疫疫苗的先期探索和尝试。方法采用酸诱导P170启动子,乳酸乳球菌本身的SP310mut2信号肽,将鼠疫杆菌LcrV抗原结构基因克隆到质粒pAM J397上,电转化感受态Lactococcus lactis PSM565。结果经重组子PCR鉴定,SDS-PAGE检测,W estern-b lot鉴定,在Lactococcus lactisPSM565/pAM J397-V培养基上清中获得了38 kD的鼠疫抗原LcrV蛋白。结论在乳酸乳球菌中成功表达了鼠疫V抗原,为下一步鼠疫黏膜疫苗的研制打下基础。     

A comparison of immunogenicity and protective immunity against experimental plague by intranasal and/or combined with oral immunization of mice with attenuated Salmonella serovar Typhimurium expressing secreted Yersinia pestis F1 and V antigen

We investigated the relative immunogenicity and protective efficacy of recombinant X85MF1 and X85V strains of DeltacyaDeltacrpDeltaasd-attenuated Salmonella Typhimurium expressing, respectively, secreted Yersinia pestis F1 and V antigens, following intranasal (i.n.) or i.n. combined with oral immunization for a mouse model. A single i.n. dose of 10(8) CFU of X85MF1 or X85V induced appreciable serum F1- or V-specific IgG titres, although oral immunization did not. Mice i.n. immunized three times (i.n. x 3) with Salmonella achieved the most substantial F1/V-specific IgG titres, as compared with corresponding titres for an oral-primed, i.n.-boosted (twice; oral-i.n. x 2) immunization regimen. The level of V-specific IgG was significantly greater than that of F1-specific IgG (P<0.001). Analysis of the IgG antibodies subclasses revealed comparable levels of V-specific Th-2-type IgG1 and Th-1-type IgG2a, and a predominance of F1-specific Th-1-type IgG2a antibodies. In mice immunized intranasally, X85V stimulated a greater IL-10-secreting-cell response in the lungs than did X85MF1, but impaired the induction of gamma-interferon-secreting cells. A program of i.n. x 3 and/or oral-i.n. x 2 immunization with X85V provided levels of protection against a subsequent lethal challenge with Y. pestis, of, respectively, 60% and 20%, whereas 80% protection was provided following the same immunization but with X85MF1.     

鼠疫耶尔森菌rV抗原单抗系统及其ELISA检测方法的建立

目的建立ELISA双抗体夹心法,测定重组毒力因子rV抗原含量。方法采用杂交瘤技术,制备鼠疫菌rV抗原的鼠单克隆抗体,对抗原表位和单抗特异性进行分析及鉴定,建立ELISA双抗体夹心法,并验证方法的专属性、准确性、精密度和线性范围。结果成功组建了鼠疫菌rV抗原诊断试剂,灵敏度最低检测值为10 ng/mL。结论该方法可用于免疫学检测鼠疫组分疫苗原液rV抗原含量及制备过程中抗原活性,是鼠疫组分疫苗制备中一种重要的质量控制手段,也为进一步开发鼠疫诊断试剂盒及其他相关研究奠定了基础。     

鼠疫耶尔森氏菌rV270抗原的克隆、表达及其免疫保护作用评价

目的：为研制鼠疫亚单位疫苗,克隆、表达并纯化去除产生免疫抑制作用序列后的鼠疫耶尔森氏菌LcrV抗原（rV270）。方法：依据已知的LcrV的核苷酸序列,避开其产生免疫抑制作用的区段设计引物,扩增rV270基因并克隆到pET24a载体中,在大肠杆菌BL21中表达His-rV270融合蛋白：表达产物先后经Co^2＋亲和层析和Sephacryl S-200HR凝胶柱纯化,并在纯化过程中应用凝血酶切除His标塔;氢氧化铝佐剂吸附重组抗原后免疫BALB／c小鼠,初次免疫后第21天加强免疫1次,第5周使用104CFU鼠疫菌141强毒株攻毒,测定其免疫保护作用。结果：rV270以可溶性方式表达;应用Co^2＋亲和层析柱和Sephacryl S-200HR凝胶柱结合凝血蛋白酶切除His标签的方法可得到不含标签的较高纯度的重组蛋白;攻毒实验中实验组小鼠全部存活,而对照组全部死亡。结论：获得了具有良好免疫保护作用的rV270蛋白,可用于鼠疫亚单位疫苗的研究。