西伯利亚PsPIP1基因的克隆及其在NaHCO3胁迫下的表达

应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术从西伯利亚蓼叶cDNA文库中克隆了质膜内在蛋白基因（PsPIP1的完整编码区cDNA序列（GenBank accession No．EU626398）,长度为1004bp,编码285个氨基酸。基于和其他植物水通道蛋白的氨基酸序列、推测的三维结构的比较以及系统进化分析结果,初步确定此基因为水通道蛋白基因家族中的PIP1亚族成员。RT-PCR结果显示,PsPIP1在西伯利亚蓼的地下茎、茎、叶中均有表达,叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低。在NaHCO3胁迫与去胁迫的过程中,此基因在地下茎、茎、叶中的表达模式也有较明显的差异。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

西伯利亚蓼PsGRX基因的克隆及其在NaHCO_3胁迫下的表达

采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术从西伯利亚蓼叶cDNA文库中克隆到谷氧还蛋白基因（PsGRX）的完整编码区cDNA序列（GenBank注册号为GU139794）,长度为465bp,编码106个氨基酸。根据与其他植物谷氧还蛋白的氨基酸序列的比对以及系统进化分析的结果,初步确定此基因为谷氧还蛋白基因家族成员。实时定量PCR的结果显示,PsGRX在西伯利亚蓼的叶、茎、地下茎中均有表达,叶中表达量最高,地下茎和茎中较低。在NaHCO3胁迫的过程中,此基因在叶、茎和地下茎中的表达模式也有较明显的差异。     

西伯利亚蓼多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼茎抑制消减文库(SSH)中获得的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting proteins,PGIP) 的EST序列,采用RACE技术在西伯利亚蓼消减库(SSH)成功克隆了PGIP蛋白基因的cDNA序列．该基因开放读码框为1 020 bp,编码339个氨基酸, 具有1段24个残基的保守亮氨酸结构域．序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有PGIPs家族共有的典型保守区域,属PGIPs家族基因,命名为PsPGIP,GenBank登录号为ACD01043．荧光定量PCR分析表明,PsPGIP在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎等器官中均有分布．在3% NaHCO₃诱导表达中,该基因在叶中表达明显受盐胁迫的诱导．推测该基因在抵御盐胁迫伤害中起到了重要的作用．     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

西伯利亚蓼铜伴侣蛋白基因在盐胁迫条件下的表达分析

铜伴侣蛋白是细胞质中负责传递铜离子的一种小分子转运蛋白,在逆境胁迫过程中铜伴侣蛋白的ATX1家族具有消除活性氧的作用．本研究应用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的铜伴侣蛋白全长cDNA序列,命名为PsATX-1．PsATX-1基因全长516 bp,其中开放读码框为228 bp,编码75个氨基酸,5′非编码区为83 bp,3′非编码区为204 bp．GenBank中登录号为EU620702．经比对发现,该基因所编码蛋白拥有重金属结合位点MXCXXC,缺少多数高等植物铜伴侣蛋白(CCH)所特有的C末端结构域（CTD）．实时荧光定量PCR分析显示,PsATX-1基因在西伯利亚蓼的地下茎、茎、叶中皆有表达,其中叶中表达量最高;PsATX-1基因受3% NaHCO3胁迫诱导,在不同部位表达模式有差异．     

西伯利亚蓼半胱氨酸合成酶基因的克隆与表达

摘要: 半胱氨酸合成酶是植物半胱氨酸合成反应的关键限速酶。文中应用RACE技术从西伯利亚蓼中成功克隆了半胱氨酸合成酶基因(GenBank登录号: EU597481), 命名为PcCSase1, 该基因全长cDNA为1 260 bp, 编码382个氨基酸。经生物信息学分析, 初步确定PcCSase1的N端前16个氨基酸为信号肽, 并引导PcCSase1蛋白定位于胞质, 为胞质型半胱氨酸合成酶。同源序列分析表明, 此蛋白与其他植物半胱氨酸合成酶成熟蛋白序列高度保守, 氨基酸相似性达到90%左右。荧光定量RT-PCR分析表明, PcCSase1在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中均有表达, 叶中表达最高, 茎和地下茎次之, 在3% NaHCO3胁迫过程中, 该基因在叶、茎和地下茎中均在第2 d表达量最高。将PcCSase1转入酿酒酵母INVSc1, 结果显示培养基中半胱氨酸和菌体中谷胱甘肽含量均有显著增加, 在10% NaHCO3和5 mol/L NaCl胁迫下, 转基因INVSc1-pYES2-PcCSase1菌株的存活率明显高于对照INVSc1-pYES2, 证明PcCSase1基因具有耐高盐的作用。     

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。     

西伯利亚蓼谷氨酰胺合成酶基因的克隆及碱性盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的谷氨酰胺合成酶基因(Glutamin synthetase,GS)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列,以下简称为PsGS基因。该序列全长1 273 bp,其5'非翻译区178 bp,3'非翻译区24 bp,开放阅读框编码356个氨基酸残基;根据与其他植物谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列的比对以及系统进化分析的结果,确定此基因为谷氨酰胺合成酶基因家族成员;经过SignalP3.0预测该蛋白没有信号肽,无切割位点,为非分泌蛋白。经过ProtParam计算该蛋白的理论等电点为5.55,分子量为39.2 kD,不稳定系数为43.82%,为非稳定蛋白。实时定量PCR分析表明,PsGS在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达。在3%NaHCO3诱导下,该基因在叶和茎中表达升高,在地下茎中表达受到抑制,推测该基因在抵御碱性盐迫时具有重要作用。     

西伯利亚蓼rd22基因的克隆与序列分析

以3% NaHCO₃溶液胁迫处理48 h的西伯利亚蓼为试材,利用RACE技术,从其茎部组织克隆了脱水应答蛋白RD22的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1 302 bp,5′非翻译区为59 bp,3′非翻译区为25 bp,开放读码框为1 218 bp,编码405个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域,N端含有5个重复序列THV-VGKGGV-V。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。其推演的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达到60%。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为DQ836050。     

百脉根液泡膜H+-PPase基因的cDNA克隆与分析

采用EST电子克隆和RACE技术从豆科模式植物百脉根中克隆到一个液泡膜H -PPase基因的cDNA,命名为LcVP1。该cDNA长为2962bp,含2304bp的完整开放阅读框,编码767个氨基酸,其推测的氨基酸序列与绿豆、拟南芥等I类液泡膜H -PPase的氨基酸序列同源性在80%以上,且有很高的功能区段保守性。该cDNA序列已提交GenBank,登录号为EF440187。半定量RT-PCR表明,LcVP1在根、茎、叶中的表达不同,叶中表达最多,茎中最少。     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

鱼腥草种质资源氨基酸组成及含量分析

分别对鱼腥草16个不同居群幼嫩地上和地下部分的氨基酸成分进行高效液相色谱分析。结果发现,鱼腥草不同居群的氨基酸含量不尽相同,同一居群幼嫩地上茎叶和地下茎的氨基酸含量也有差异,多以地上茎叶高于地下茎。在分析的17种氨基酸中,所有居群均含有16种氨基酸,都不含Cys-SS-Cys。地上部分氨基酸中Glu含量最高,His含量最低;地下部分氨基酸中Glu含量最高,Tyr含量最低。地上部分氨基酸总量以W01-16为最高,而地下部分氨基酸总量以W01-99为最高,分别为27.89mg/g和15.46mg/g。蕺菜与峨眉蕺菜间氨基酸成分间无显著差别。鱼腥草种质资源氨基酸含量与染色体数目间相关不显著。     

Cloning and characterization of a SnRK1-encoding gene from <Emphasis Type="Italic">Malus hupehensis</Emphasis> Rehd. and heterologous expression in tomato

Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase-1 (SnRK1) plays an important role in metabolic regulation in plant. To understand the molecular mechanism of amino acids and carbohydrate metabolism in Malus hupehensis Rehd. var. pinyiensis Jiang (Pingyi Tiancha, PYTC), a full-length cDNA clone encoding homologue of SnRK1 was isolated from PYTC by Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). The clone, designated as MhSnRK1, contains 2063 nucleotides with an open reading frame of 1548 nucleotides. The deduced 515 amino acids showed high identities with other plant SnRK1 genes. Quantitative real-time PCR analysis revealed this gene was expressed in roots, stems and leaves. Exposing seedlings to nitrate caused and initial decrease in expression of the MhSnRK1 gene in roots, leaves and stems in short term. Ectopic expression of MhSnRK1 in tomato mainly resulted in higher starch content in leaf and red-ripening fruit than wild-type plants. This result supports the hypothesis that overexpression of SnRK1 causes the accumulation of starch in plant cells. All the results suggest that MhSnRK1 may play important roles in carbohydrate and amino acid metabolisms.     

Molecular characterization of tobacco mitochondrial L-galactono-gamma-lactone dehydrogenase and its expression in Escherichia coli

A cDNA clone encoding L-galactono-gamma-lactone (GAL) dehydrogenase (EC 1.3.2.3) was isolated from tobacco leaves. The cDNA clone contained an open reading frame encoding the protein of 501 amino acids with a calculated molecular mass of 56,926 Da, preceded by a putative mitochondrial targeting signal consisting of 86 amino acid residues. In fact, GAL dehydrogenase was localized in the mitochondria of tobacco cells. The deduced amino acid sequence of the cDNA showed 77 and 82% homology to cauliflower and sweet potato GAL dehydrogenases, respectively. Southern blot analysis showed that tobacco contains one copy of the gene for the enzyme. Northern blot analysis showed that GAL dehydrogenase mRNA (2.0 kb) is expressed in the leaves, stems, and roots in almost equal quantities. We introduced the cDNA clone encoding tobacco GAL dehydrogenase into a pET expression vector to overexpress this protein in Escherichia coli. The partially purified recombinant enzyme was used for comparative studies on the native enzymes from tobacco and other sources; its enzymatic properties were similar to those of other GAL dehydrogenases.