RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

基因治疗新前沿：反基因技术

反基因技术是以脱氧寡聚核苷酸与双链ＤＮＡ分子序餐特异性结合形成三链ＤＮＡ,从而在转录水平上调控基因的一种基因治疗策略。     

多聚酶链反应——方法和仪器

<正>多聚酶链反应(PCR)类似体内DNA复制过程,在待扩增的“靶”或“模板”DNA双链分子的的两端各接一个引物,经一次循环后,可得到两个相同的双链靶DNA分子。DNA分子数随循环次数呈几何级数增长,30次循环后,靶DNA被放大2~(30)倍,其拷贝数可达10~9以上,在100ul PCB反应混合物中约产生2～3μ DNA。扩增的靶DNA分子长达10～18kb,但4kb抗更短的靶DNA最适宜PCR扩增,PCR能测出10~6基因组中的一个DNA拷贝。     

双链DNA 膜效应在序列点突变电化学检测中的应用

报道一种基于金表面的双链DNA膜效应检测DNA点突变的新方法。致密的双链DNA分子层可以将电化学信号分子禁闭在金表面和双链DNA之间,或者将信号分子与金表面隔离开,使其无法接触裸金面．在实验系统中采用Fe(CN）6^3-为信号分子,在升高温度时,双链DNA膜被破坏,信号分子离开或接触金表面,解链曲线会出现一个陡峭的电化学信号变化。在特定的温度下,完全互补的序列和单碱基点突变的序列的信号比达到了100：1。这种方法简单而且灵敏,同时避免了复杂的共价修饰信号分子的过程。     

三核苷酸双链重复序列扩展合成特性及其机理

简单重复序列在各种生物基因组中广泛存在,同分子进化、遗传多样性、分子标记和某些遗传性疾病等密切相关．本文以全部32种18 bp三核苷酸双链重复序列作为研究对象,对它们在聚合酶作用下的扩展合成进行了系统研究．探讨了反应温度、序列本身等对扩展效率和产物长度的影响．结果显示,几乎所有的序列都能扩展变长．但序列对其扩展效率有很大影响：GC含量较多的短链,尤其是一条链中同时有G和C的短链扩展效率较高;全由AC和GT组成的双链也较易扩展．短链的最适扩展温度与短链GC组成呈一定的正相关关系．琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现,大部分产物单一性良好,且产物分子质量的大小随反应时间线性增加;随着反应温度升高,产物差异性增大．最后分析了双链重复序列的“复制滑移”扩展机理,有望为进一步研究重复序列的分子进化和基因检测中的非特异性扩增等奠定基础．     

非全长链合成导致连续聚合酶链式反应(PCR)扩增失败和复杂产物的形成

在进行连续PCR(以产物为模板进行多轮次的连续重复PCR扩增)实验时, 我们观察到了一种新的异常现象—— 用不同来源的模板连续PCR扩增不同长度的靶序列最终都会导致扩增失败, 表现为在常规琼脂糖电泳检测时特异产物条带的消失和不能泳动出点样孔之复杂异常产物的出现. 连续PCR扩增失败的时期依扩增靶序列的长度不同而不同, 越长的靶序列在连续PCR中扩增失败的时期越早. 扩增得到的复杂产物主要由连续分布的小于靶序列长度的具有相当程度多样性的非全长链组成. 复杂产物在内部具有局部的双链区域和大量的单链区域而在外部具有单链分支结构, 能够被单链特异的S1核酸酶消化, 但是不能被双链特异的限制性内切酶消化. 人工处理完整双链形成的非全长链长产物与完整双链以不同比例混合后作为模板进行连续PCR, 结果表明同源的非全长链成分对PCR扩增有严重的干扰作用. 已有的证据表明PCR扩增过程中形成的非全长链成分是导致这种异常现象的关键因素, 多个不同长度的非全长链复性形成“杂种分子”最终表现为复杂产物. 连续PCR扩增失败、PCR介导重组和长片段PCR难于操作有共同的产生基础—— 扩增过程中非全长链成分的产生. 任何降低PCR扩增过程中非全长链成分产生的措施, 特别是聚合酶忠实性的提高, 都能缓解异常扩增产物的出现和利于长片段PCR操作.     

生物工程技术讲座(九)

双链的DNA分子是由一条单链上的碱基与另一条单链上碱基相配对组成。分子中的碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)间有两处,鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)间有三处通过氢(H)结合配对,形成双链间的对应互补。由H在双链分子间形成的结合虽稳定,但是可逆的即经加热或碱     

胰岛素晶体中水的一般结构及作用

在1.8A分辨率胰岛素同晶置换结构的基础上,运用差值付里叶技术研究了胰岛素晶体中水的结构和作用。晶胞中大约三分之一的水呈结合状态,它们与胰岛素分子彼此以氢键结合。在差值图上,这部分水分子表现清晰而肯定,显示出有序状态。胰岛素分子A、B链各氨基酸残基的极性和荷电基团,除已经彼此以氢键或盐键形成给体-受体“配偶”者和处于分子内部者外,其余几乎都与水分子相结合。蛋白质分子表现出最大限度结合水的倾向。一些水桥和水网络作用于胰岛素分子的A、B链之间和二聚体之间,对胰岛素分子A、B链的正确相关以及二聚化和六聚化都有重要意义。显然通过水分子的作用,使极性和荷电基团形成最大限度的给体-受体“配偶”,是稳定蛋白质三维结构的一个重要因素。大约三分之二的水分子,围绕胰岛素分子形成近似“水合层”的结构。它们在差值电子密度图上,表现弱而弥散,显示出是一些有序性较差的分子。通过结合水在蛋白质分子表面形成一些“抛锚点”,可能是这类水与蛋白质分子相作用的一条途径。它们较大的游动性,对蛋白质分子的动力学性质可能有重要意义。     

胰岛素晶体中水的一般结构及作用

在1.8分辨率胰岛素同晶置换结构的基础上,运用差值付里叶技术研究了胰岛素晶体中水的结构和作用。晶胞中大约三分之一的水呈结合状态,它们与胰岛素分子彼此以氢键结合。在差值图上,这部分水分子表现清晰而肯定,显示出有序状态。胰岛素分子A、B链各氨基酸残基的极性和荷电基团,除已经彼此以氢键或盐键形成给体-受体“配偶”者和处于分子内部者外,其余几乎都与水分子相结合。蛋白质分子表现出最大限度结合水的倾向。一些水桥和水网络作用于胰岛素分子的A、B链之间和二聚体之间,对胰岛素分子A、B链的正确相关以及二聚化和六聚化都有重要意义。显然通过水分子的作用,使极性和荷电基团形成最大限度的给体-受体“配偶”,是稳定蛋白质三维结构的一个重要因素。大约三分之二的水分子,围绕胰岛素分子形成近似“水合层”的结构。它们在差值电子密度图上,表现弱而弥散,显示出是一些有序性较差的分子。通过结合水在蛋白质分子表面形成一些“抛锚点”,可能是这类水与蛋白质分子相作用的一条途径。它们较大的游动性,对蛋白质分子的动力学性质可能有重要意义。     

抗辐射菌中DNA损伤修复主要基因群的研究进展

抗辐射红色球菌对电离辐射具有很高的放射线抵抗性,该菌具有惊人的DNA的二条链切断的修复能力,由辐射等引起的切断损伤DNA在几至十几小时内能高效正确地进行完全修复。在对切断的双链DNA进行修复时,除了大肠杆菌等生物在切断的双链DNA修复时出现的蛋白质以外,还有该菌所特有的修复蛋白质也参与修复。本文对该菌所特有的DNA二条链的切断损伤修复的主要基因及其相互作用进行了简要介绍。     

DNA计算与生物数学

介绍了一门新的科学领域－DNA计算的一些基本概念和基础知识,并提出了一些创造性的看法,而且给出了一些新的结论。主要从以下几个方面叙述：DNA计算的常用操作、DNA计算的几种形式化模型、并以其中一种模型为例证明了DNA计算的完备性和通用性,还介绍了DNA计算的重要机制,自装配的基本概念及自装配常用分子,并给出了一些常用分子的自装配与形式语言产生过程的对应,证明了双链分子的自装配能够产生线性语言对应的分子链,不同于一般认为的双链分子仅能产生正规语言相对应的分子链。另外,自装配的复杂度也是一个很重要的内容,最后提出了对DNA计算这一新兴领域的前景及发展的创造性看法。     

几种限制性核酸内切酶的纯化

通常所说的限制性内切酶或限制酶实际上是指Ⅱ类脱氧核糖核酸内切酶。此类酶能够识别双链DNA分子上的特定核苷酸顺序,并在这特定的顺序处将DNA的双链切断。各种不同的限制酶都有它自己的识别顺序,所产生的片段的末端电不尽相同。自从Smith于1970     

核酸杂交技术及其在登革病毒中的应用

<正>一、引言 核酸杂交技术是一种发展很快、应用极广的分子生物学方法。它利用核苷酸碱基互补配对的原理,通过一段已知特异性的核酸分子,标记上特定的示踪物质作为探针,在液相或固相中与待测标本中的特异性核酸反应,探针与标本核酸的互补单链经氢键作用而形成双链。然后,通过一定的程序显示杂交双链的存在、状态、大小或数量进行检测。故核酸杂交亦称分子杂交(moiecular hybridization)。     

体外缺血/再灌注神经元DNA损伤的初步研究

目的和方法：应用胎鼠皮层细胞原代培养,建立神经元的体外“缺血／再灌注”模型,观察神经元缺血／再灌注后DNA链的损伤。应用PANT和TUNEL染色分别检测缺血／再灌注后DNA单链和双链损伤。结果：神经元缺糖缺氧２h引起极少量细胞死亡,4h引起少于30％的细胞死亡,而6－8h的缺糖缺氧引起的细胞死亡数量达到80％以上,6h缺糖缺氧再灌注10－18h,细胞死亡达高峰,而在8h缺糖缺氧再灌注2h细胞死亡已经达高峰。在缺糖缺氧2,4,6,8h灌注5min,PANT阳性细胞分别达30％,50％,80％,90％。而在同样的情况下,TUNEL染色阳性细胞数没有明显增加。结论：体外神经元缺糖缺氧再灌注早期即出现DNA链的损伤,且以单链损伤为主。     

要鼓励学生发表意见

一堂课中,老师常会遇到学生提问、质疑或争辨,即通常所说的“插嘴”。如,师:“每个染色体含有一个DNA分子(甲种本第130页)。”生:“不准确。应该是:每个染色体上至少含有一个DNA分子。在细胞分裂间期,染色体复制,每个染色体的着丝点连着两个染色单体(姊妹染色单体),而每个染色单体上有一个DNA分子,直到分裂后期,染色单体分开之前,每个染色体上都有二个DNA分子。”     

线粒体遗传病

线粒体(mitochondrion)是一个敏感而多变的细胞器,是细胞中能量储存和供给的场所。除细菌、蓝绿藻和哺乳类动物成熟红细胞外,所有的真核细胞都有线粒体。1963年Nass在对鸡卵母细胞的研究中首次发现线粒体拥有自己特异的遗传物质——线粒体DNA(mtDNA)。近年来,人们发现线粒体DNA突变与许多人类疾病有关,因而,mtDNA已成为分子遗传学和临床医学所关注的一个热点。1　mtDNA的结构特征mtDNA与核DNA不同,其形状类似于原核细胞的DNA,呈裸露环状。人mtDNA为全长16569bp的双链闭环分子,外环为重链(H链),内环为轻链(L链)。H链与L链的碱基…     

核糖体失活蛋白与超螺旋DNA相互作用的原子力显微镜直接观察

运用原子力显微镜研究了核糖体失活蛋白 (RIP)与超螺旋DNA相互作用 ,发现这类毒蛋白 (克木毒蛋白和蓖麻毒蛋白A链 ) ,既能与超螺旋形式的DNA结合 ,又能结合在超螺旋DNA分子中未解旋的双链环区 .在与超螺旋DNA结合后 ,引起超螺旋DNA构象变化以利解旋并与双链DNA结合 ,进而将松弛的DNA双链切成缺口或线性形式 .这说明RIP是一种超螺旋DNA结合蛋白 ,并表现出依赖超螺旋的DNA内切酶活性     

R环的形成及对基因组稳定性的影响

R-环是由一个RNA:DNA杂交体和一条单链状态的DNA分子共同组成的三链核酸结构。其中, RNA:DNA杂交体的形成起因于基因转录所合成的RNA分子不能与模板分开, 或RNA分子重新与一段双链DNA分子中的一条链杂交。在基因转录过程中, 当转录泡遇到富含G碱基的非模板链区或位于某些与人类疾病有关的三核苷酸卫星DNA时, 转录泡后方累积的负超螺旋可促进R环形成。同时, 新生RNA分子未被及时加工、成熟或未被快速转运到细胞质等因素也会催生R环。研究表明, 细胞拥有多种管理R环的方法, 可以有效地管理R环的形成和处理已经形成的R环, 以尽量避免R环对DNA复制、基因突变和同源重组产生不利影响。文章重点分析了R-环的形成机制及R环对DNA复制、基因突变和同源重组的影响, 并针对R-环诱导的DNA复制在某些三核苷酸重复扩增有关的神经肌肉退行性疾病发生过程中的作用进行了分析和讨论。     

核酸分子中碱基含量的计算

关于核酸分子中碱基含量的计算,在遗传学和高中生物教学中相当重要,但在教科书中通常没有专门讲述。我们根据碱基互补配对规律及中心法则进行归纳总结,从DNA结构、DNA复制、转录、翻译等方面探讨了DNA、RNA、蛋白质3者之间的关系,分析了核酸分子中碱基的含量。互核酸分子中碱基含量的计算1．且已知双链DNA分子中一种碱基的含量,推断其他碱基的含量：例1：一双链‘DNA分子中,（A－C）占碱基总量的Zo％。求A、T、G、C各占多少？解：在双链DNA分子中,据规律知,1．2由碱基含量推断核酸分子的结构——单链或双链、DNA或RNA…     

数学思维方法在生物学教学中的应用

数学思维方法常用于定量研究生物学问题。近年来在“3 X”高考、会考、竞赛的代谢、遗传、生态和生理等部分知识点的考查中被广泛应用 ,包括数列、不等式、数形结合、恒等变形、概率原理和比例的性质等方面。1　数列例 1,某 DNA用3 2 P进行标记 ,该 DNA分子复制 n次后 ,新形成的 DNA的分子中 ,含有原来母链中标记链 DNA分子占新 DNA分子的百分比是多少 ?解析 :双链 DNA复制时 ,所得的 DNA分子数为 2 n个 (n为复制次数 ) ,由于 DNA分子为半保留复制 ,不管DNA分子复制多少次所形成的新 DNA分子中含有标记链的 DNA分子始终是 2…