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1.
【目的】L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸。为了增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的代谢流向,优化L-缬氨酸前体物质的供应,以一株积累L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌V1(Corynebacterium glutamicum V1)为对象,构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因敲除的重组菌株C.glutamicum V1-Δpepc,并研究pepc敲除后菌株生理特性的改变。【方法】运用交叉PCR方法得到pepc基因内部缺失的同源片段Δpepc,并构建敲除质粒pK18mobsacB-Δpepc。利用同源重组技术获得pepc基因缺陷突变株C.glutamicum V1-Δpepc。采用摇瓶发酵对C.glutamicum V1-Δpepc进行发酵特性的研究。对谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicum ATCC 13032、出发菌株C.glutamicum V1和敲除菌株C.glu-tamicum V1-Δpepc的丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydro-genase,PDH)、丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PC)分别进行测定和分析。【结果】PCR验证以及PEPC酶活测定都表明筛选到pepc缺陷的突变菌株C.glutamicum V1-Δpepc,摇瓶发酵结果表明,突变菌株C.glutamicum V1-Δpepc不再积累L-缬氨酸而是积累L-精氨酸达到7.48 g/L。酶活测定结果表明出发菌株的PDH和PC酶活均低于模式菌株C.glu-tamicum ATCC13032和重组菌株C.glutamicum V1-Δpepc,出发菌株的PK与PEPC酶活与模式菌株没有较大的差异。【结论】研究表明,通过切断PEPC参与的三羧酸循环的回补途径,增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的流向使丙酮酸向TCA循环的流量增加,精氨酸的累积量提高。同时,以丙酮酸为前体的L-缬氨酸和丙氨酸的积累量降低。 相似文献
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【目的】谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的主要菌株,以缬氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌V1为研究对象,探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)介导的草酰乙酸回补途径对菌株生理特性以及主要氨基酸代谢流量的影响。【方法】通过基因工程手段,在谷氨酸棒杆菌V1中过表达pepc(编码PEPC)和pck(编码PCK),比较重组菌与出发菌关键酶活性、发酵特性以及主要氨基酸积累量变化。【结果】构建两株重组菌V1-pepc(强化草酰乙酸回补途径)和V1-pck(弱化草酰乙酸回补途径),重组菌生长均较出发菌延缓,总生物量、葡萄糖和硫酸铵消耗基本不变;过表达pck,PCK活性提高22.8%,丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸积累量分别提高了11.8%、17.2%、27.8%和19.5%;过表达pepc,PEPC活性提高27.5%,同时PC活性降低12.9%,天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的整体流量变化不大,丙氨酸族氨基酸的整体流量降低了14.7%。【结论】丙氨酸族氨基酸受此回补途径影响较大,天冬氨酸族氨基酸受此影响较小。 相似文献
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纯化的高梁叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)经不同浓度的盐酸胍处理变性失活后,在试验的蛋白浓度范围内,它的失活时间进程的动力学分析表明为一级反应。0.4 M盐酸胍处理25分钟后(O℃),酶的催化活性完全丧失,酶蛋白的远紫外圆二色性光谱、内源荧光光谱及免疫特异性等测定均表明酶的结构发生了深刻变化。甘油及PEP羧化酶的变构效应剂G6P和甘氨酸对酶在盐酸胍溶液中的变性作用有一定的保护效果。变性酶用复性缓冲液稀释20倍后,在最佳条件下,再经30分钟保温,酶的催化活性能恢复70%以上。G6P和甘氨酸能促进变性酶的复性,甘油亦有明显效果。随着酶活性的恢复,它的远紫外圆二色性、内源荧光及免疫特异性也随之恢复,变性酶的复性速率在常温下(25℃)比在低温下(0℃)要快得多。 相似文献
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水分胁迫对露花磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶表达水平及特性的影响 总被引:4,自引:1,他引:3
水分胁迫能引进露花叶片PEP羧化酶的活力,酶蛋白和mRNA水平的提高。复水后,叶片PEP羧化酶表达量降低,茎中的PEP羧化酶在水分胁迫和恢复水分供应过程中变化情况与叶片相似,兼性CAM植物的碳代谢类型转变发生在植物的绿色组织中。 相似文献
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植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能及其在基因工程中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)是广泛存在的一种细胞质酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸(OAA),后者可转化生成三羧酸循环的多种中间产物.PEPC在植物细胞中参与植物的光合碳同化等重要代谢途径,并且在不同组织中具有多种生理功能.PEPC同时也参与调控植物种子的营养物质合成与代谢过程,控制糖类物质流向脂肪酸合成或蛋白质合成途径.以下介绍了植物PEPC的种类、蛋白质结构特点及其在植物组织中的调控方式,并重点论述了PEPC在生物基因工程中的应用方面的进展,随着对其功能机制和应用研究的深入,将有助于植物PEPC在高产优质农作物育种、能源植物和工业微生物等的开发利用等方面得到更好的发展与应用. 相似文献
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蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的生物信息学分析 总被引:1,自引:1,他引:1
应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站对蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)与其他物种进行序列同源比对,分析相同的保守序列及催化活性位点,构建分子进化树;预测跨膜结构、疏水性/亲水性、二级结构、功能域和模体等.结果显示,蓝藻PEPC与高等植物、细菌、真核藻PEPC同源性都比较低(约为33%),但是它们含有两个类似的活性部位和相同的催化活性位点;该蛋白质是非跨膜的亲水性不稳定蛋白,二级结构以a-螺旋和无规则卷曲为主,舍有一个功能结构域,主要的功能是参与氨基酸的合成. 相似文献
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运用CRISPR/Cas系统敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其对脂肪酸代谢的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】CRISPR/Cas是目前基因编辑的一个重要的新兴技术,拟通过该技术,对大肠杆菌进行快速、高效的基因编辑,获取脂肪酸代谢工程菌。【方法】利用一个二元载体构建出CRISPR/Cas偶联λ-Red重组酶的系统,重叠PCR扩增出敲除的Donor,最后用电转的方式对Escherichia coli MG1655脂肪酸代谢相关基因进行快速编辑。同时,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对脂肪酸进行定性及定量分析。【结果】获得了大肠杆菌ΔPEPC(partial)、ΔPEPC、ΔPEPC(partial)-ΔFad D、ΔPEPC-ΔFad D以及ΔFad D突变体菌株。各缺失体菌株脂肪酸含量均比野生型要高,最高的增长了3.7%,但是敲除ppc获得的脂肪酸增长量并没有预期的高。同时在脂肪酸组成上,各菌株均含有11:0、12:0、13:0、14:0、15:0、16:0、17:1、17:0、18:0,并且16:0,17:0,18:0占主要组成部分。【结论】运用该技术可以快速、高效地对大肠杆菌基因进行编辑,是大肠杆菌工程菌株构建的一个新思路,对其他工程菌的构建提供了一定的理论基础。 相似文献
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过量表达Bacillus subtilis磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶对大肠杆菌产琥珀酸的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
在大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)皆可催化由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸(OAA)的反应。鉴于经由PCK催化的反应伴有ATP的生成,理论上更有利于菌体生长和产酸,本研究以大肠杆菌W3110(△pfl,△ldh)为出发菌株,利用λ-Red同源重组系统构建了其ppc缺陷菌株并在此基础上过量表达了Bacillus subtilispck基因。初步的厌氧发酵实验表明:过量表达pck可在一定程度上恢复初始菌株厌氧代谢葡萄糖的能力。其中又以ppc缺陷株更为明显,其耗糖能力和产酸能力分别为对照菌株的4.2和15.3倍。 相似文献
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高粱幼苗黄化叶片经照光转绿后,其PEP-Case活性提高4~15倍,mRNA含量提高了1.03倍,并测定出PEPCase mRNA的分子量为3.4kb。以等量的总RNA及mRNA进行体外翻译,发现转绿后PEPCase专一性翻译活性提高了51%~53%。这表明光照可以在转录水平上调节PEP-Case的基因表达。 相似文献
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【目的】转酮酶是非氧化磷酸戊糖途径中的关键酶。从北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense PD-67)中克隆转酮酶(transketolase,EC2.2.1.1,TK)基因,并将转酮酶基因在C.pekinense PD-67中进行表达,研究增加转酮酶活性对C.pekinense PD-67生理特性的影响。【方法】分别以C.pekinense野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增tkt的全基因序列和前端控制序列;通过pAK6载体提高tkt基因在C.pekinense PD-67中的拷贝数,从而提高C.pekinense PD-67中转酮酶的活性。【结果】tkt基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与结构分析结果表明,C.pekinense突变株PD-67与野生株AS1.299相比较,二者调控序列及结构基因核苷酸序列完全一致。与谷氨酸棒杆菌ATCC13032相比较,突变株PD-67的氨基酸序列有5个氨基酸差异,其中4个位于与辅因子硫胺素焦磷酸结合的结构域内。突变株PD-67来源的tkt基因在北京棒杆菌PD-67中得到了表达,重组菌转酮酶比活力比对照菌株提高了2倍。C.pekinense PD-67(pTK3)与对照菌株PD-67(pAK6)相比,生长加快,L-色氨酸的最终积累量也较高。【结论】本工作从C.pekinense1.299和PD-67中克隆到tkt基因,并实现tkt基因的同源表达。适当提高菌株转酮酶活力,有助于菌体生长和色氨酸积累。 相似文献
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摘要:【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶( EC:2.7.2.11,γ-glutamyl kinase) 基因proB 敲除的菌株,并研究proB 基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR 技术分别扩增proB 基因的上游和下游序列,构建带有内部缺失的proB 基因的敲除载体。经过两次同源重组,敲除C.crenatum 8-193 的pro 相似文献
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[目的]为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲除的菌株,研究aroP基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响.并进一步研究在aroP敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响.[方法]运用PCR技术扩增aroP基因,与整合质粒连接后,用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP基因的敲除载体.利用同源重组技术,敲除北京棒杆菌PD-67的aroP基因,构建菌株PD-67 ΔaroP,并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP进行互补验证.采用PCR技术扩增AS基因,与表达载体连接构建重组质粒.将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP,构建工程菌株PD-67 ΔaroP/pXAS.通过摇瓶发酵研究PD-67 AaroP和PD-67 ΔaroP/pXAS的发酵特性.[结果]经PCR验证获得了aroP基因缺陷的菌株.摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65%.酶活分析结果表明,AS基因在菌株PD-67 △aroP中得到表达.AS基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25.6%.[结论]北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因arop的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量.在arop基因敲除菌中表达AS基因,可以进一步提高工程菌的产酸率. 相似文献
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Bernhard J. Eikmanns Max T. Follettie Martin U. Griot Anthony J. Sinskey 《Molecular & general genetics : MGG》1989,218(2):330-339
Summary The ppc gene of Corynebacterium glutamicum encoding phosphoenolpyruvate (PEP) carboxylase was isolated by complementation of a ppc mutant of Escherichia coli using a cosmid gene bank of chromosomal c. glutamicum DNA. By subsequent subcloning into the plasmid pUC8 and deletion analysis, the ppc gene could be located on a 3.3 kb SalI fragment. This fragment was able to complement the E. coli ppc mutant and conferred PEP carboxylase activity to the mutant. The complete nucleotide sequence of the ppc gene including 5 and 3 flanking regions has been determined and the primary structure of PEP carboxylase was deduced. The sequence predicts a 919 residue protein product (molecular weight of 103154) which shows 34% similarity with the respective E. coli enzyme.
Present address: Institut für Biotechnologie 1 der Kernforschungsanlage, Postfach 1913, D-5170 Jülich, Federal Republic of Germany 相似文献
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以北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增了邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因(trpEG)片段和前端控制序列。核酸序列分析结果表明,该片段全长3374bp,包含3个ORF,推测分别为前导肽基因trpL、AS componentⅠ基因trpE和AS componentⅡ基因trpG。C.pekinense野生株AS1.299与突变株PD-67相比较,trpL基因完全一样;trpE基因有6个碱基的突变,导致了5个氨基酸残基的改变;trpG基因有1个碱基的突变,导致了1个氨基酸残基的改变;同时它们在-35序列处还有一个A→G的突变。通过同源性比较发现,C.pekinense AS1.299与Corynebacterium glutamicum ATCC13032和Brevibacterium lactofermentum的亲缘关系是很近的。trpL基因上游存在启动子区域,并能被Escherichiacoli的RNA聚合酶所识别,实现异源互补。野生型和突变型AS基因在C.pekinense AS1.299和PD-67中都得到表达,并且重组菌相对于宿主菌的酶活都有了很大提高。摇瓶发酵实验结果表明,带有突变型AS基因的PD-67重组菌生长比较慢,稳定期比PD-67推迟24h,但产生的L-色氨酸比PD-67高22.39%。 相似文献
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Diethyl oxaloacetate was found to be a competitive inhibitor of maize leaf phosphoenolpyruvate carboxylase activity with respect to the substrate phosphoenolpyruvate. The Ki values, based on total diethyl oxaloacetate, decreased with increasing pH, while the Ki values, based on the enol tautomer (average of 4 M), were similar and independent of pH. The results suggest that inhibition is dependent on the enol tautomer. Diethyl oxaloacetate was a weak inhibitor following treatment of the enzyme with dithiothreitol; inhibition could be restored by treatment with diamide, indicating inhibition depends on the reduction state of thiol groups on the enzyme.Abbreviations DTT
dithiothreitol
- HPLC
high performance liquid chromatography
- EDTA
ethylenediaminetetraacetic acid
- Hepes
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
- MES
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
- MOPS
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
- Tricine
N-tris(hydroxymethyl)methylglycine 相似文献