利用氨甲蝶呤－琼脂糖凝胶进行噬菌体展示人肝脏cDNA文库筛选的方法研究

目的：利用氨甲蝶呤（MTX）偶联琼脂糖凝胶吸附法从人肝脏细胞cDNA噬菌体展示文库中筛选与MTX相互作用的蛋白。方法：以偶联于琼脂糖凝胶表面的MTX为配基,通过"结合－洗脱－扩增"过程筛选与MTX相互作用的噬菌体。利用PCR对筛选结果进行监测,对筛选得到的噬菌体PCR产物进行序列测定和基因同源性分析。结果：通过五轮亲和筛选富集到特异噬菌体克隆,再通过PCR获得cDNA插入片段。通过BLAST程序搜索GenBank,证明筛选到的片段与人PI-3K相关蛋白激酶 SMG-1异构体1 蛋白同源性达100％。结论：利用偶联MTX的琼脂糖凝胶作为筛选基质,从T7噬菌体展示cDNA文库中富集特异噬菌体是一种方便、高效的MTX相互作用靶蛋白筛选方法。本方法可为探讨小分子药物的分子作用机制提供借鉴和参考.     

噬菌体cDNA文库筛选方法的改良

cDNA文库的构建和简便、快速的筛选是获得全长基因的重要途径,基于PCR的筛库方法具有快捷、灵敏的特点。研究改进了基于PCR的噬菌体cDNA文库筛选方法,用液体分装的方法,替代了文库筛选的关键步骤——涂板分区,省去了噬菌体文库铺平板、浸染、培养、划块洗脱的操作过程,使筛库的工作量减少,进一步提高了筛选速度和获得阳性克隆的效率。     

噬菌体展示文库筛选技术的研究进展

噬菌体展示技术是将编码外源蛋白或多肽的基因片段定向插入到噬菌体的外壳蛋白基因区,使外源蛋白或多肽通过与噬菌体外壳蛋白融合而表达并展示于噬菌体表面,进而筛选表达特异蛋白或多肽的噬菌体,已发展成为生物学后基因组时代一个强有力的实验技术.噬菌体展示文库的筛选是其关键环节.为了提高筛选效率,许多研究者对传统的筛选技术进行了改进,如选择性感染噬菌体、迟延感染性噬菌体、以DNA为基础的筛选方法、亲合力捕获和反复筛选和封闭筛选法等,用于筛选的靶标也越来越具有多样性,使得这一技术有了更加广阔的发展前景.     

人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库的构建与鉴定

[目的]构建人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示c DNA文库,为研究人尿道上皮细胞与生殖道感染病原体的相互作用奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取SV-HUC-1细胞总RNA,分离纯化出mRNA,经反转录合成得到其双链c DNA,在双链c DNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端,然后收集并纯化200bp以上的双链c DNA片段,连接于T7噬菌体载体,经体外包装后转入BLT5403宿主菌,T7噬菌体展示c DNA文库构建成功。[结果]将文库扩增后,用噬斑试验检测其库容,结果为1.2×106pfu/cm3。用PCR鉴定随机挑取的噬菌斑,计算其重组率达93.75%,且插入片段都大于200bp。[结论]成功构建了SV-HUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库,为下一步研究泌尿生殖道感染病原体与人尿道上皮细胞的相互作用奠定了前期实验基础。     

日本血吸虫童虫裂解物对东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的筛选及阳性克隆分析

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为筛选和分析东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因, 以日本血吸虫童虫可溶性裂解物为探针, 筛选东方田鼠肝脏噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选, 特异性噬菌体得到有效富集(375倍)。随机挑取92个克隆进行序列测定, 获得了19条有效EST序列。其中13个条EST序列与已知基因或表达序列标签同源, 6个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性, 为新的表达序列标签。将19个EST序列的阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养, 其中4号(GenBank Accession No.: EW968294)、13号(GenBank Accession No.: EW968303)、14号(GenBank Accession No.: EW968304)、15号(GenBank Accession No.: EW968305)、18号(GenBank Accession No.: EW968308)克隆均诱导了显著的杀虫效果。综合生物信息学分析结果及体外杀伤试验结果, 编码CASP8和FADD类似性细胞程序性死亡调节蛋白、a-2-HS-糖蛋白、M4蛋白、具有R3H结构域的一种mRNA结合蛋白以及三种未知蛋白的编码基因(14、15、18号克隆)可能是东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因。为进一步研究东方田鼠抗血吸虫机理奠定了基础。     

日本血吸虫童虫裂解物对东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的筛选及阳性克隆分析

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为筛选和分析东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因, 以日本血吸虫童虫可溶性裂解物为探针, 筛选东方田鼠肝脏噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选, 特异性噬菌体得到有效富集(375倍)。随机挑取92个克隆进行序列测定, 获得了19条有效EST序列。其中13个条EST序列与已知基因或表达序列标签同源, 6个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性, 为新的表达序列标签。将19个EST序列的阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养, 其中4号(GenBank Accession No.: EW968294)、13号(GenBank Accession No.: EW968303)、14号(GenBank Accession No.: EW968304)、15号(GenBank Accession No.: EW968305)、18号(GenBank Accession No.: EW968308)克隆均诱导了显著的杀虫效果。综合生物信息学分析结果及体外杀伤试验结果, 编码CASP8和FADD类似性细胞程序性死亡调节蛋白、a-2-HS-糖蛋白、M4蛋白、具有R3H结构域的一种mRNA结合蛋白以及三种未知蛋白的编码基因(14、15、18号克隆)可能是东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因。为进一步研究东方田鼠抗血吸虫机理奠定了基础。     

分子文库展示技术

分子文库展示技术是一系列广泛应用于多肽、蛋白质及药物筛选和研究蛋白质间相互作用的有效的生物学技术。它将组合成的具有一定长度的随机序列寡核苷酸片段(或cDNA)克隆到特定表达载体中,使其表达产物(多肽片段或蛋白质结构域)以融合蛋白的形式展示在活的噬菌体或细胞表面。根据其蛋白质表达是否依赖于宿主表达系统,分为体内表达展示系统和无细胞展示系统(体外表达展示系统)。就其展示的部位不同又可分为噬菌体展示技术、细胞表面展示技术、核糖体展示技术、mRNA展示技术等。现对各种展示技术的基本原理及相关应用做简要综述。     

BLyS改组噬菌体文库的构建及初步筛选

从质粒pT7474-BLyS及人胎脑cDNA文库中分别扩增出BLyS和APRIL基因,用DNase I消化后,回收小于50 bp的片断,用于DNA改组。PCR产物与噬菌体载体pfUSE5连接后,电转E.coliER2738获得改组文库。构建的改组文库库容量为8.9×105。对文库进行初步的筛选,获得了一个受体结合活性降低的突变克隆。成功构建了BLyS改组噬菌体文库,为蛋白结构与功能之间关系的深入研究打下了基础。     

从噬菌体多肽文库中筛选α—葡萄糖苷酶的抑制剂

以黑曲霉葡糖淀粉酶为靶分子,筛选噬菌体展示的多肽文库,经过3轮生物淘选法筛选,得到3个特异性结合的噬菌体克隆,分别命名为GB-1、GB2和GB-3。其插入多肽中都含有一对二硫键,破坏二硫键将大大降低噬菌体与葡糖淀粉酶的结合。化学合成的环状多肽KCHFEECLAY,其序列对应于结合力最强的一个克隆GB-1的N端的10个氨基酸残基,该多肽可以竞争性地抑制黑曲霉葡糖淀粉酶（Ki=0.2mmol/L)以及大鼠小肠的α-葡萄糖苷酶（Ki=1.4mmol/L)。     

噬菌体展示重组人淋巴毒素突变体库及受体亲和筛选

淋巴毒素 (lymphotoxin , LT) 通过 TNFR1 受体传递凋亡信号,从而发挥抗肿瘤活性 . 对 LT 的受体结合区域进行多点随机突变,利用噬菌体展示重组人淋巴毒素 (rhLT) R46 , S106 , L130 三点随机突变组合文库和 S106 ～ F110 区域随机突变体库 . 噬菌体库与固相化 TNFR1 受体进行亲和筛选,富集了能与 TNFR1 受体结合的 rhLT 突变体 . 随机挑选 20 个单克隆噬菌体进行 ELISA 受体结合鉴定,其中 80 ％的克隆与 TNFR1 受体特异性结合,有 4 个克隆与 TNFR1 受体的结合能力高于野生型序列的 rhLT. 将这 4 个结合力高的突变体克隆于 pET32a(+) 载体,经过大肠杆菌表达和纯化操作后,检测这些突变体蛋白与 TNFR1 受体的结合活性和对 L929 细胞的杀伤活性,发现 3 个克隆的受体结合性质与其展示于噬菌体上时基本吻合,其中 C199 克隆与 TNFR1 的结合活性比野生型序列的 rhLT 提高了近 30 ％,且其对 L929 细胞的杀伤活性提高了近 90%. 应用噬菌体展示技术对淋巴毒素进行体外进化研究的尝试,为下一步的蛋白质结构和功能研究提供了思路,可成为大分子药物开发的有效工具 .     

人类天然抗α-Gal抗体抑制肽的筛选

人类天然抗体可以与猪细胞抗原表位Gal-α1,3-Gal结合,触发超急性排斥反应（HAR）,HAR是猪器官移植至人体时的首要障碍.阻断人的天然抗体,阻止其与猪细胞表面特异性抗原的结合,是防止超急性排斥的有效措施.利用噬菌体展示技术,从XCX₁₅随机肽库中筛选与西非单叶豆凝集素(GS-I-B₄）特异性结合的噬菌体展示肽.得到一个小肽序列为SCTALSFPSFAFLARGT,其与人血清中天然抗体的结合可以被蜜二糖（melibiose）竞争性地抑制,同时该小肽还能抑制人类天然抗体介导的猪红细胞的凝集反应.因此,筛选到的小肽能作为人天然抗α-Gal抗体的抑制肽.     

趋化因子受体 CCR5 亲合短肽的筛选

趋化因子受体 5 (CCR5) 是 HIV-1 与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被 CCR5 拮抗剂封闭则会阻止 HIV-1 感染细胞 . 为得到与 CCR5 特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达 CCR5 的 CHO 细胞 (CHO/CCR5) 作为靶标,通过噬菌体随机 12 肽库筛选与 CCR5 特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选 20 个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到 11 个含有 AFDWTFVPSLIL 序列的小分子肽 . 含该序列的噬菌体能与抗人 CCR5 单抗 (2D7) 竞争性结合 CCR5 ,且合成肽 AFDWTFVPSLIL 对趋化因子 RANTES 与 CHO/CCR5 的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与 CCR5 具有特异性结合作用 .     

从人白细胞cDNA文库筛选凋亡素相互作用蛋白

来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白-凋亡素(apoptin)能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,为研究其选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制,利用酵母双杂交系统筛选从人白细胞cDNA文库筛选apoptin相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,其中一个与ABP280（actin-binding protein 280）有高度同源性.细胞免疫共沉淀实验结果显示：在哺乳动物细胞水平仍能够检测到apoptin与ABP280片段的特异的相互作用.分别构建缺失C端11个氨基酸、中间33～46位氨基酸和二者均缺失的apoptin的3个突变体, 突变体与ABP280相互作用研究表明：apoptin的33～46位氨基酸（核外运信号）对于apoptin 与ABP280的相互作用是必需的,而C端核定位信号/DNA结合序列对于apoptin 与ABP280的相互作用不是充分必要的.     

人肝细胞内戊型肝炎病毒结合蛋白的酵母双杂交筛选

为进一步深入研究戊型肝炎病毒(HEV)感染机制以及致病机理,用酵母双杂交系统从人肝细胞cDNA文库中筛选与戊型肝炎病毒衣壳蛋白E2相互作用的蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,4个克隆与E2相互作用,其中一个克隆与P38IP高度同源,细胞免疫共沉淀实验结果显示:在哺乳动物细胞水平仍能够检测到E2与P38IP片段的特异的相互作用。     

利用噬菌体表面展示技术筛选转铁蛋白黏附肽的研究

为了筛选转铁蛋白黏附肽,应用噬菌体表面展示技术经过三轮生物淘选,成功地从随机七肽库中得到黏附转铁蛋白的重组噬菌体克隆,经过相对亲和力常数测定和DNA测序得到4个转铁蛋白黏附肽的序列。实验中以回收率和选择比为操作参数,对淘选进行了优化,并发展了一种基于噬菌体滴度的相对亲和力常数测定方法。转铁蛋白受体是一种有效的肿瘤标记物,利用转铁蛋白为载体可以实现药物靶向运输,因此转铁蛋白黏附肽将是重组蛋白质药物连接转铁蛋白的有用标签。     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

以GST融合蛋白为靶从噬菌体肽库中筛选结合肽

以重组的谷胱甘肽S-转移酶（GST）和目标蛋白的融合蛋白为靶,通过将其固定于谷胱甘肽琼脂糖凝胶上,可以方便地从噬菌体肽库中筛选目标蛋白的结合肽.用此方法筛选到含WWXF结构的HIV-1病毒蛋白R（Vpr）的结合肽,与经典的将Vpr包被于培养板上的筛选方法相比,此方法具有简便、快速的优点.     

凋亡蛋白和Nmi的相互作用及作用位点的筛选鉴定

为研究来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质———凋亡蛋白 (apoptin)诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人白细胞cDNA文库筛选凋亡蛋白相互作用蛋白质 ,核苷酸序列分析及同源性检索表明 ,其中一个约为 1.2kb的克隆与Nmi(N Mycinteractionprotein)高度同源。细胞免疫共沉淀实验结果显示 ,在哺乳动物细胞水平仍能够检测到凋亡蛋白与全长Nmi的特异相互作用。利用构建好的分别缺失C端 11个氨基酸、中间 33～46位氨基酸和二者均缺失的 3个凋亡蛋白突变体进行相互作用位点研究 ,结果表明凋亡蛋白的 33～ 46位氨基酸(核外运信号 )对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用是必需的 ,而C端核定位信号 /DNA结合序列对于凋亡蛋白与Nmi的相互作用不是充分必要的     

利用噬菌体肽库筛选与HIV-1p24抗原结合的多肽

通过噬菌体展示技术筛选出与HIV-1p24抗原结合的多肽,为用多肽辅助p24抗原检测提供实验基础.以重组p24抗原为靶蛋白,对噬菌体随机七肽库进行三轮筛选,用EUSA鉴定第三轮筛选到的噬菌体克隆与p24重组抗原的结合能力,再对噬菌体克隆进行测序分析,同时研究了ELISA中噬菌体加入量及多种封闭剂对噬菌体特异性结合能力的...     

正常人肝细胞cDNA文库的构建及应用分析

目的利用Gubler-Hoffman法构建了正常人肝细胞的cDNA文库以筛选肝细胞内部与乙肝病毒感染相关的基因。方法首先采用TRIzol法提取正常人肝细胞总RNA,纯化mRNA。逆转录合成单链cDNA,然后合成双链cDNA。用Spin Column回收0.4kb以上片段,然后与Vector pAP3neo进行连接,利用电刺激转化法导入E.coliDH10B,利用PCR法检测文库的重组效率。结果扩增后的文库重组率为93.3%。结论已经成功地构建了正常人肝组织的cDNA文库,该文库可用于筛选与乙肝相关的基因及用于基因芯片的制作。