tdTomato转基因小鼠的建系及其在细胞示踪方面的应用研究

目的构建稳定表达的tdTomato转基因小鼠并建系,观察其细胞及组织的荧光表达水平以及其干细胞共培养后的荧光表达水平。方法使用Gateway clone技术和DNA显微注射法构建含有tdTomato表达载体的受精卵,移植至假孕母鼠体内,待其自然生产。使用双向鉴定法鉴定并挑取饲养阳性小鼠并建系。另提取tdTomato阳性小鼠的神经干细胞分别与eGFP小鼠的骨髓间充质干细胞、原代神经干细胞共培养。结果成功构建了tdTomato转基因小鼠并建系,与野生型小鼠相比,tdTomato转基因小鼠生化指标和生长性状无明显差异,其组织切片及脑源神经干细胞均可观察到红色荧光。示踪实验表明注射部位可观察到明显的荧光成像,共培养实验可以清晰的观察到细胞分化后荧光的稳定表达。结论 tdTomato转基因小鼠的组织和细胞能稳定表达红色荧光,可以利用荧光鼠的自发荧光特性,研究干细胞共培养后的分化方向。     

红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立

目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chicken-βactin强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型,活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的组织形态。结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠。活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。经荧光显微镜观察,DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高。EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达,尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高。结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达,成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠。DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型。     

EGFP—pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的EGFP—pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定。方法从pEGFP—N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP—pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到Fr67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功构建EGFP—pBABE重组质粒。该质粒转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达。结论成功构建表达EGFP的EGFP—pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础。     

建立绿色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系及向心肌样细胞的分化

带有GFP基因的ESD3细胞系是一个良好的可以用于研究体内和体外细胞分化和组织产生的模型。用磷酸钙共沉淀法将质粒pEGFP-N2导入小鼠胚胎干细胞D3细胞系中 ,在荧光显微镜下以 488nm激发光检查阳性克隆 ,并进行初步扩增。经G4 18筛选后 ,机械挑取EGFP强阳性表达的克隆 ,并在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上 ,在无选择性压力的条件下 ,进一步扩大培养 ,获得纯化的转染细胞系。20代以后 ,转染细胞仍然表达绿色荧光蛋白。PCR检测表明 8代和 18代转染细胞均携带有GFP标志基因。对稳定表达EGFP的干细胞系进行碱性磷酸酶染色、拟胚体和畸胎瘤形成的检测 ,证明这些细胞具有干细胞的特征。经拟胚体 ,可进一步分化成具有搏动能力的心肌细胞 ,分化百分率为 30 %～ 4 0 % ,较未转染细胞 60 %～ 70 %的分化率低 ,造成低分化率机制还不清楚。这些细胞在激光共聚焦显微镜下呈绿色荧光 ,免疫组化染色显示具心肌细胞特异的cTnT分子标志。该EGFP标记的干细胞系带有可进行原位、实时检测的绿色荧光 ,可应用于细胞移植和体内分化的研究.     

绿色荧光转基因大鼠模型的建立

目的随着干细胞研究的推进,大鼠干细胞的研究日趋迫切。本研究旨在为活体荧光影像系统、干细胞归巢、细胞移植体内示踪研究,提供绿色荧光蛋白EGFP转基因大鼠模型。方法通过显微注射方式获得EGFP转基因大鼠,采用活体荧光影像系统、激光共聚焦显微镜,对EGFP转基因大鼠各个组织的荧光表达水平进行比较;采用流式细胞术检测转基因大鼠血液和骨髓细胞、骨髓干细胞的荧光标记率,筛选骨髓干细胞高效标记绿色荧光的转基因大鼠。结果建立了心脏、肝脏、肌肉、肺、胰腺、脑、膀胱、胃、肾脏、肠和脾脏组织中,系统性表达EGFP的SD-TgN（ACT-EGFP-1）ZLFILAS转基因大鼠;流式细胞术检测表明,该品系血液细胞绿色荧光标记率为94.4%,骨髓干细胞绿色荧光标记率为97.8%。结论建立了多组织系统性高表达绿色荧光,骨髓干细胞荧光标记率高达95%以上的转基因大鼠,为影像分析,造血干细胞的归巢等研究提供了大鼠模型。     

辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率

构建可表达增强型绿色荧光蛋白 (Enhanced green fluorescent protein,EGFP) 的辅助病毒依赖型腺病毒载体 (Helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达,电镜下观察到经CsCl纯化后的腺病毒的典型形态。分光光度计法测定病毒的浓度为4.0×1012 颗粒数 (Virus particle,vp) /mL。与可表达EGFP的第一代腺病毒载体 (First generation adenoviral vector,FGAd) FGAd/EGFP进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究,分别用约2 000 vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞,流式细胞仪检测EGFP的表达情况。通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况,可见HDAd/EGFP感染早期的A549细胞较FGAd/EGFP有更高的荧光表达率及更高的表达强度,显示HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性,是一种更有价值的疫苗载体。     

荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra(Stimulated by Retinoic Acid)基因。从鼠源分离得到的Stra8基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8基因的启动子序列(1.4kb)。将Stra8基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

建立对未分化细胞特异性标记的小鼠胚胎干细胞系

构建pRex-1-EGFP表达载体,电穿孔转染小鼠ES细胞,用增强绿色荧光蛋白对起源于3．5d胚泡内细胞团的小鼠胚胎干细胞进行特异性标记,用荧光显微观察EGFP的表达以及RT-PCR方法检测Rex-1基因在未分化和分化中ES细胞中的表达情况。结果显示,EGFP基因成功转入小鼠ES细胞,并在未分化的ES细胞中高效表达;细胞开始分化后,EGFP的表达开始下降。由Rex-1基因启动子控制下的EGFP稳定表达的小鼠ES细胞系,对哺乳动物早期发育过程的研究以及对筛选能够调节上述过程的小分子化合物具有重要意义。     

一种原位示踪外源目的基因表达载体的构建

应用分子克隆技术 ,分别将增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)、内部核糖体进入位点 (internalribosomeentrysite,IRES)和编码H-ras基因C端 2 0个氨基酸的DNA(rasc2 0 )片段插入真核表达载体pcDNA3,构建真核重组表达载体并将其命名为pZX。通过脂质体介导将该载体转染人宫颈癌细胞系HeLa ,培养过夜后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的分布 ,并与pEGFP-C3质粒DNA转染该细胞系进行比较。结果表明 ,转染pZX载体的实验组细胞膜发出绿色荧光 ,而对照组绿色荧光则均匀弥散于整个细胞中 ,工具性载体pZX已构建成功     

胎鼠脊髓源性神经干细胞分离培养与鉴定

目的:研究胎鼠的脊髓源性神经干细胞的分离培养方法并观察其增殖和分化能力。方法:利用显微操作技术分离获得胎鼠脊髓组织、无血清培养技术和酶消化法结合机械法传代培养神经干细胞、免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞和分化情况。结果:建立了胎鼠脊髓源性神经干细胞的分离、培养和鉴定的方法,观察到了脊髓源性神经干细胞具有较强的增殖能力,在添加有5ng／mlEGF和5ng／mlbFGF的无血清培养液中可贴壁分化为神经元、少突细胞和星形胶质细胞。结论:在体外培养条件下分离培养的胎鼠脊髓源性神经干细胞具有干细胞的特性即较强的增殖能力和多向分化潜能。     

荧光转基因斑马鱼Tg(ttn.2:EGFP)的构建

为了建立一种用于研究肌肉和心脏发育及其相关疾病的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因斑马鱼品系,本研究使用斑马鱼ttn.2基因编码区上游启动子序列和绿色荧光蛋白基因编码序列构建了重组表达载体,并将该载体和Tol2转座酶的加帽mRNA显微共注射入斑马鱼1-细胞期胚胎,通过荧光检测、遗传杂交筛选和分子鉴定等方法,成功建立了能稳定遗传的Tg(ttn.2:EGFP)转基因斑马鱼品系。荧光表达分析及原位杂交分析结果表明,绿色荧光信号在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达模式与ttn.2基因的mRNA表达一致。通过反向PCR鉴定转基因表达载体在F1代斑马鱼品系中的随机整合位点,结果表明:No.33转基因品系的EGFP基因整合在斑马鱼的4号和11号染色体上,No.34转基因品系则整合在1号染色体上。该荧光转基因斑马鱼品系Tg(ttn.2:EGFP)的成功构建为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。此外,绿色荧光强烈表达的斑马鱼品系还可以作为一种新的观赏鱼。     

一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法

目的 :利用Fugene 6基因转染试剂建立一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法 ,并建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)报告基因的人胚胎干细胞系 ,为人胚胎干细胞研究提供一个非常有用的细胞模型。方法 :通过Fugene 6基因转染试剂成功地将EGFP基因转入无饲养层培养的人胚胎干细胞中 ,嘌呤霉素筛选得到稳定表达EGFP的克隆 ;利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP在人胚胎干细胞中的表达情况。结果 :EGFP瞬时转染效率为 30 %～ 40 % ,稳定转染效率约 1/10^4～5,且稳定转染的人胚胎干细胞均表达EGFP。结论 :Fugene 6是一种良好的基因转染试剂 ,它可以有效地将外源基因转入人胚胎干细胞中 ,为人胚胎干细胞的转基因研究提供新的实验手段。     

体细胞核移植生产绵羊转hALR基因囊胚

扩增人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,利用质粒pIRES2-EGFP 构建新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体.LipofectAMINETM介导其转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,sFFCs);经G418筛选转基因细胞;激光共聚焦显微镜挑选绿色荧光单克隆细胞.PCR、RT-PCR和免疫组织化学方法进一步检测ALR基因及其表达;稳定表达外源基因的sFFCs作供体,移入去核的绵羊卵母细胞中,进行体细胞核移植.通过激光共聚焦显微镜和ALR抗体检测EGFP、ALR基因在胚胎水平上的表达,其结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因可在绵羊胎儿成纤维细胞内同时表达,由此细胞核移植产生的转基因胚胎在发育的各阶段均可见绿色荧光;囊胚中所有细胞表达EGFP基因;发绿色荧光的胚胎中ALR基因同时存在.因此,由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可简化检测目的基因的繁琐手段;用筛选的转基因早期胚胎进行移植,可提高制备转基因动物的效率.     

慢病毒介导EGFP转染骨髓间充质干细胞在胶质瘤模型中迁移分布的研究

目的:如何证实骨髓间充质干细胞(BMSCs)是胶质瘤基因治疗中最好的药物载体?将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的大鼠骨髓间充质干细胞移植入大鼠C6胶质瘤模型脑内,观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的迁徙与定位。方法:贴壁法培养大鼠骨髓细胞获取纯化的BMSCs。慢病毒介导EGFP转染BMSCs,于荧光显微镜下观察EGFP的表达,并行流式细胞仪检测EGFP阳性转染率。利用立体定向仪将培养好的C6细胞注入大鼠脑内,建立大鼠脑内胶质瘤模型。将标记EGFP的BMSCs利用微量注射器注入模型鼠脑内;移植后第1,7天处死大鼠,用荧光显微镜观察BMSCs在肿瘤内的迁移分布。结果:实验成功建立了大鼠脑内胶质瘤模型。以EGFP标记的BMSCs在模型鼠脑内主动迁移分布于肿瘤内部及肿瘤与正常脑组织交界侧。结论:骨髓间充质干细胞可以作为肿瘤基因治疗的良好载体。     

MiR-31转基因小鼠的构建及其在组织器官的表达

目的 构建稳定过表达的miR-31转基因小鼠,检测其主要组织器官中miR-31的表达变化情况并对在体miR-31过表达的应用提供合格的工具鼠。方法 使用Gateway cloning技术构建miR-31过表达载体,使用DNA显微注射技术将构建好的载体注入受精卵内,随后转移至假孕母鼠内,待其自然生产。将新生小鼠提取尾部DNA,PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定miR-31过表达阳性小鼠,筛选阳性小鼠并饲养繁殖。另取阳性小鼠,提取主要组织器官的miRNA并使用RT-PCR检测其miR-31的表达量。同时对比阳性小鼠和野生型小鼠神经系统中Nestin的表达和神经干细胞的数量。结果 成功构建了miR-31过表达转基因小鼠,并在屏障环境下饲养繁殖至14代以上。各主要组织器官miR-31的表达均升高且稳定表达。阳性小鼠Nestin的表达和神经干细胞数量均高于野生型小鼠。结论 通过使用Gateway cloning技术成功构建了miR-31过表达转基因小鼠,且在各代小鼠中miR-31的表达稳定,神经系统内的神经干细胞数量多于野生型小鼠,可为进一步研究miR-31过表达后在体内的功能和神经系统疾病的治疗提供良好的工具小鼠。     

家蚕转基因载体pBacA3EG的构建及其表达

以家蚕Bombyx mori肌动蛋白A3(actin 3)启动子、增强性绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因及SV40的多聚腺苷酸识别序列为元件,经多次克隆,将其插入到piggyBac转座载体中。经PCR、酶切鉴定及测序表明各元件已按正确的方式插入到piggyBac载体中。将构建好的piggyBac表达载体显微注射到胚盘形成前期的蚕卵中,在胚胎早期发育的第3天,通过体视荧光显微镜检测到蚕卵内发出较强的绿色荧光。结果表明该载体构建正确且能在蚕卵中进行表达。家蚕转基因载体的体外瞬时表达不但是成功进行家蚕转基因所必需的第一步,而且其自身也可以应用于基因的功能研究,为家蚕后基因组研究奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白标记兔间充质干细胞体外复合小肠黏膜下层的生长特性

目的利用绿色荧光蛋白（EGFP）标记兔来源的骨髓间充质干细胞（BMSC）,观察其作为种子细胞复合SIS基质体外培养的生长特性,为复合物回植体内时间提供参考。方法通过物理和化学方法制备小肠黏膜下层（SIS）;取新西兰大白兔分离BMSC,体外培养增殖至P3代,行转染增强型EGFP,转染前后根据增殖速度,绘制生长曲线。然后将转染后的第3代间BMSC,以30×106的浓度接种于1 cm×1 cm大小的SIS支架材料上培养。观察细胞转染后的生长特性,检测复合后的细胞总数,荧光显微镜观察复合后细胞形态。结果 BMSC经转染后生长增殖速度未受明显影响。细胞DNA检测显示复合物培养第7天培养结果显示细胞增殖状态最佳差异有统计学意义（P〈0.05）。荧光显微镜观察显示复合物培养7天细胞增殖良好差异有统计学意义（P〈0.05）,第10天后呈现老化状态。结论增强型的EGFP转染不影响间充质干细胞传代以及增殖。间充质干细胞-SIS基质复合物体外培养7 d回植较为合适。     

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG蛋白表达载体的构建及鉴定

目的：构建心肌特异性α-肌球蛋白重链（α—myosin heavy chain,α—MHC）启动子启动E1A基因阻遏子（cellular repressor of E1A—stimulated genes,CREG）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合的真核表达载体。绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体。方法：用BamHI和EcoRI双酶切pcDNA3．1myc—His／hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-N1;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经AseI和NheI双酶切得到启动子α—MHC,亚克隆入pCREG—EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG—EGFP-N1,测序鉴定。用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果：成功构建pα—MHC—CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Westem blot检测到CREG蛋白的表达。结论：重组质粒pα-MHC—CREG—EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础。