牛成纤维细胞的分离与体外培养

研究了牛胎儿和成年牛皮肤组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征。通过组织块贴壁培养和分离单细胞接种培养均能获得原代牛皮肤细胞。用2.5 g/L胰蛋白酶+1mmol/L EDTA和5 g/L胶原酶I联合消化牛皮肤组织较2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化,得到更多的单个细胞,两者之间差异极显著(P<0.01),但其死细胞比率却有较大升高;2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化牛胎儿组织得到的单细胞数显著高于皮肤组织消化后得到的细胞数(P<0.01),死细胞比率也高于同种酶消化的皮肤组织。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化贴壁细胞后死细胞率明显高于用0.5g/L胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA消化的细胞(P<0.05);培养24 h后细胞贴壁率前者要明显低于后者(P<0.05)。用0.5 g/L胰蛋白酶轻度消化混杂生长的成纤维细胞和上皮样细胞,经过反复贴壁传代2～3代,可得到较纯的成纤维细胞。     

水牛胎儿成纤维细胞体外培养体系的初步建立

为探讨适合水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的体外培养体系,采用常规组织块法和胰蛋白酶消化法原代培养BFF均获得了较多的成纤维细胞,但后者所得细胞的活力不如前者高,且死细胞也较多;传代或冻存成纤维细胞时用4℃预冷的胰蛋白酶室温下消化所得的细胞比37℃热消化的细胞更圆、更有光泽;跟踪32代的细胞冷冻复苏率均达70%～80%;染色体分析结果显示,二倍体细胞所占比例始终保持在80%～90%之间,各代细胞(5th、10th、15th)之间差异不显著(P>0.05).结果 表明,组织块法原代培养、4℃预冷胰蛋白酶室温消化传代细胞的培养体系比较适合水牛胎儿成纤维细胞的培养.     

酶消化对肿瘤浸润淋巴细胞活力影响的研究

本文系统地研究了酶消化（胶原酶Ⅳ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和胰蛋白酶）对肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）活力、增殖力等影响,并用单个酶消化法与Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ法比较。结果提示：胶原酶Ⅳ或胶原酶Ⅱ消化肿瘤组织块时对ＴＩＬ细胞活力、增殖力损伤小;透明质酸与胰蛋白酶消化对ＴＩＬ细胞活力、增殖力损伤大。在３７℃,１ｈ消化组与４℃,２４ｈ消化组对同一来源肿瘤组织酶消化配对比较中,结果提示同一酶４℃,２４ｈ消化比３７     

胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是目前国际上公认的人胚胎干细胞(hESCs)体外培养的饲养层细胞,但MEFs存在寿命短、动物源性污染等问题,需要探索适于hESCs体外培养且寿命长的人源性饲养层.采用胰蛋白酶消化法和组织块法分别原代培养人包皮成纤维细胞(hFFs),探索hFFs原代培养的最佳方法,为hFFs作为饲养层在hESCs研究中的应用提供可靠的科学依据;通过倒置显微镜下观察其生长状态和免疫细胞化学染色鉴定,结果显示两种原代培养方法获得的hFFs的形态及生物学特性均符合成纤维细胞;通过测定细胞生长曲线及MTT法检测,结果显示两种原代培养方法获得的不同代数的hFFs均具有较高的增殖活性,传代10余代仍能保持较好的细胞形态,可以制备成饲养层用于hESCs的研究.     

大鼠表皮细胞的体外培养及纯化方法

根据表皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性、贴壁时间及要求不同的,采用胰蛋白酶消化法和反复贴壁法相结合,能有效清除成纤维细胞的混合生长,获得纯化的表皮细胞。本方法经济、简便、实用。     

酶消化对肿瘤浸润淋巴细胞活力影响的研究

本文系统地研究了酶消化(胶原酶Ⅳ、胶原酶Ⅱ,透明质酸酶和胰蛋白酶)对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)活力、增殖力等影响,并用单个酶消化法与Rosenberg法比较。结果提示:胶原酶Ⅳ或胶原酶Ⅱ消化肿瘤组织块时对TIL细胞活力、增殖力损伤小;透明质酸酶与胰蛋白酶消化对TIL细胞活力,增殖力损伤大。在37℃,1h消化组与4℃,24h消化组对同一来源肿瘤组织酶消化配对比较中,结果提示同一酶4℃,24h消化比37℃1h消化对TIL细胞增殖力损伤小,与Rosenberg方法比较中也发现单一胶原酶消化比三酶联合消化影响小。配对各实验组TIL细胞~3H-TdR掺入率分析中,也反映了类似变化。本文经4℃,24h胶原酶Ⅳ消化后培养的TIL细胞在60天和75天仍对自身靶细胞有杀伤力。     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性

目的:建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法,并探索其生物学特性。方法:取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤,配制2种血清的细胞培养液,采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度;通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。结果:背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7 d无细胞游出,CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少;经组织块贴壁法细胞生长慢,培养周期长;酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。尾尖取材量少,得到细胞少;耳部皮肤取材方便,但细胞纯度低。CCK8增殖曲线呈S型;相较于对照组,UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。结论:CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案,可增加细胞得量、缩短培养周期,降低成本。     

人正常食管鳞状上皮不同原代培养方法的比较

该研究通过比较人正常食管鳞状上皮不同的原代培养方法,以期为不同的实验目的提供不同的培养方法。实验用到的正常食管粘膜上皮来源于食管癌患者手术切除的标本,采用组织块法和酶消化法,分别用DMEM/F12混合培养基和K-SFM无血清培养基进行培养。通过直接观察、细胞形态学观察和免疫细胞化学方法观察细胞的生长情况、细胞形态学特征及鉴定所得到的细胞,比较不同方法与不同培养基组合中原代培养细胞的生长状况。用组织块法,在DMEM/F12混合培养基中人正常食管上皮细胞生长较好,细胞融合较快,成纤维细胞污染较少,15～17天上皮细胞铺满瓶底的70%～80%,获得的细胞数量大,但细胞传代后成纤维细胞污染严重。用酶消化法,在K-SFM无血清培养基中人正常食管上皮细胞生长好,细胞融合快,成纤维细胞污染基本消除,细胞纯度高,10～12天细胞便可以铺满瓶底的70%～80%,这种方法培养的细胞可以冻存、复苏和传代。其余各种培养方法所得细胞无论在生长状态、培养周期、成纤维细胞污染和传代方面均较前两种方法差。以上各种方法培养的细胞经免疫细胞化学染色鉴定证实细胞呈广谱细胞角蛋白阳性,确定是食管上皮来源的细胞。酶消化法加K-SFM无血清培养基是本实...     

树鼩原代皮肤成纤维细胞的分离培养技术

建立稳定的树鼩(Tupaiabelangeri)皮肤成纤维细胞的体外培养体系,可为有关此类细胞的实验和疾病树鼩细胞模型提供技术支持。取树鼩大腿内侧皮肤用组织块贴壁法和胶原酶Ⅰ消化法分离皮肤细胞,胰蛋白酶差别消化法纯化细胞;用MEM(10%FBS)完全培养基和含低血清生长添加物(LSGS)的培养基培养细胞;免疫荧光和蛋白印迹法鉴定细胞,并测定细胞的生长、冻存和复苏特性。经树鼩皮肤细胞分离效果比较,胶原酶消化法比组织块贴壁法更适合用于树鼩原代皮肤细胞分离;对分离及冻存复苏后细胞生长状况观察比较发现,添加了LSGS的MEM培养基更利于细胞存活、生长;细胞形态观察、免疫荧光和蛋白印迹检测鉴定所分离的细胞为树鼩皮肤成纤维细胞。成功建立了树鼩原代皮肤细胞的分离、纯化方法,并优化了该细胞的培养条件。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果 0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显;DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的对影响东方田鼠胚胎成纤维细胞（MfEF）分离和培养的因素进行探索,并观察其生物学特性。方法取室内繁殖饲养不同胎龄的东方田鼠胚胎分离成纤维细胞,通过原代和继代培养,分析比较不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度等因素对MfEF分离及培养的影响,观察MfEF的生长形态及其生物学特性。结果 MfEF为贴壁型生长,细胞形态多样,呈梭形、不规则多边形;采用0.125%的胰蛋白酶室温消化12～13 d胚胎组织5 min,以DMEM培养基添加15%小牛血清分离培养MfEF的效果最佳;MfEF2～7代增殖最旺盛。结论获得了实验室分离、培养MfEF的有效方法 ,为进一步深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定了基础。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代。并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色。结果倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性。结论建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞。     

ICR胎鼠成纤维细胞培养方法的优化

目的确定胎鼠成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）最优制备方法,为MEF的制备节省时间与原材料。方法取胎鼠组织,采用组织块培养法、胰酶消化培养法、胰酶消后组织块培养法进行分离培养MEF,比较观察MEF纯度、生长速度、细胞形态等指标,筛选最节省时间与原料的一种培养方法。结果组织块培养法所得MEF生长速度慢,细胞体积小,杂细胞少,纯化所需传代次数少。胰酶消化培养法的MEF生长速度快,体积较大,杂细胞数量多,纯化所需传代次数较多。胰酶消化后组织块培养法的消化后组织块的成纤维细胞生长速度介于前两种方法之间,细胞体积和形态与组织块法培养结果相似,杂细胞数量较少,纯化所需传代次数少。结论胰酶消化结合组织块培养法能最大限度的利用材料,在短时间内可制备大量MEF,满足核移植试验与作为饲养层细胞的需求。因此,胰酶消化结合组织块培养法是MEF最优培养方法。     

新生大鼠肺成纤维细胞的原代培养改良法及细胞鉴定

探讨新生大鼠肺成纤维细胞原代培养的改良方法及细胞鉴定。用胰酶消化组织块结合的方法提取新生大鼠肺成纤维细胞,并纯化细胞,对肺成纤维细胞进行形态学观察,用HE染色及免疫组化染色法对细胞进行鉴定,并用MTT法测定细胞生长曲线。倒置相差显微镜下观察选用改良法获得的细胞,3 d后可见组织块周边有少许细胞,5 d后组织块周围有大量细胞爬出,生长迅速,10 d接近融合。经改良后的方法纯化细胞,细胞活性状态较好的为3~5代,5代以后的细胞增殖能力下降。对第3代肺成纤维细胞进行HE染色,镜下可见形态典型的成纤维细胞,免疫组化结果显示波形蛋白(Vi-mentin)阳性表达,细胞角蛋白(cytokeratin)阴性表达。MTT法检测第3代细胞于3~5 d处于对数生长期。胰酶消化组织块结合法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化的培养方法,使用这种方法可得到具有典型形态特征且活性较好的肺成纤维细胞,初学者容易掌握。     

小鼠卵巢生殖干细胞分离培养鉴定

通过比较不同酶分离方法获得小鼠（Mus musculus）卵巢生殖干细胞的数量以及不同饲养层培养卵巢生殖干细胞的生长状态,筛选出最佳酶分离方法和饲养层,以期建立更优化的培养体系,并对优化培养体系长期培养的卵巢生殖干细胞进行功能鉴定。选取5日龄C57BL/6雌性乳鼠卵巢,机械法制备卵巢组织碎片后,分别采用传统两步酶法（胶原酶和胰蛋白酶）和改良两步酶法（胶原酶、DNA酶、透明质酸酶、分离酶Ⅱ和胰蛋白酶）分离卵巢生殖干细胞,差速贴壁法纯化后,观察不同酶消化方法对卵巢生殖干细胞数量的影响;将分离得到的卵巢生殖干细胞分别培养于小鼠胚胎成纤维细胞STO系[sandosinbred mice(SIM)embryo-derived thioguanine and ouabain-resistant]、多聚赖氨酸以及明胶3种不同的饲养层,观察卵巢生殖干细胞的生长增殖状态;将传至第6代的卵巢生殖干细胞用碱性磷酸酶检测法和免疫荧光法对卵巢生殖干细胞标志物MVH、Oct4、C-kit和增殖标记物Brdu进行鉴定。结果发现两种酶分离方法均可从卵巢中分离得到卵巢生殖干细胞,其中传统两步酶法获得的细胞经差速贴壁法纯...     

组织块法和酶消化法体外培养原代鼠阴道上皮细胞的研究

为探讨更佳的阴道上皮细胞体外培养技术,为组织工程化阴道动物模型提供种子细胞,分别应用组织块法和酶消化法原代培养大鼠阴道上皮细胞,观察两种方法细胞生长所需时间、细胞形态和生长特性,免疫组化进行鉴定。结果表明,两种细胞培养方法均能获得不规则圆形或多边形的阴道上皮细胞,其传代后增殖特性和生长曲线基本一致,角蛋白染色阳性,但酶消化法较组织块法细胞贴壁快、生长时间短、产量大、细胞纯度高、能较迅速获得较多细胞用于组织工程阴道的构建。     

一种简单、经济、高效的大量肝细胞培养方法

采用组织“切割分离法”加“胰蛋白酶消化法”两种传统方法的组合,获得细小的肝组织块进行贴壁法培养,待肝细胞长满瓶底(肝细胞为主)即传一代(目的去组织块及其他间质细胞),继续培养可获得高密度、高纯度、高活力的肝实质细胞。本实验方法操作简单、经济、高效,适用于一般实验室进行大规模肝细胞培养的细胞培养方法。     

RA滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的:改良体外分离、培养类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的方法,并进行鉴定。方法:取关节镜手术中获得RA患者滑膜组织进行机械分离、胶原酶消化后直接将所有消化产物置于细胞培养皿两次贴壁培养,差速消化法纯化成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术及免疫细胞化学的方法鉴定细胞纯度。结果:胶原酶消化后直接贴壁结合差速消化纯化法分离获得的原代滑膜细胞中呈梭形的成纤维样细胞占98%以上,细胞核呈椭圆形位于细胞中央,偶见少量圆形的滑膜巨噬细胞。流式细胞术显示98%以上的滑膜细胞具有vimeintin+CD68的成纤维细胞特征。免疫细胞化学提示滑膜细胞vimentin表达阳性、CD68不表达。结论:成功分离获得了纯度和活性很高的人滑膜成纤维样细胞,方法更简便,效率更高,为后续类风湿性关节炎滑膜侵袭机制的研究奠定了基础。     

体外培养小鼠下颌下腺细胞生长特性的实验研究

目的：研究小鼠下颌下腺细胞的培养方法,探讨下颌下腺细胞培养条件及细胞生长特性,为研究干细胞转分化涎腺腺泡细胞以及涎腺再生研究奠定理论基础和技术支持。方法：取2周龄的小鼠,组织块法和消化法分别进行培养,用活细胞观察法和HE染色法记录细胞形态学特征;免疫荧光染色法鉴定;通过生长曲线和细胞倍增时间来比较两种方法对细胞增殖能力的影响。结果：组织块法和消化法均可以成功的培养下颌下腺细胞,（1）组织块法培养的细胞呈卵圆形或多边形,10天左右成铺路石样;消化法培养细胞亦为上皮样细胞,呈多边形,胞质丰富;（2）HE染色下颌下腺细胞呈多边形,胞核明显;（3）Cytokeratin13和AQP5表达阳性,Wimentin表达阴性;（4）组织块法培养细胞增殖相对较平缓,消化法培养细胞增长较迅速;（5）消化法培养倍增时间（1．3471±0．6071）天比组织块法倍增时间（2．1887±1．1503）明显缩短（P〈0．05）;结论：体外可以成功的培养下颌下腺细胞,但是同时证明下颌下腺细胞长期传代较困难,这为研究干细胞转分化涎腺细胞和涎腺再生体内实验提供了理论和实验基础。