结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法

通用引物与载体多克隆住点两端序列互补,将目的片段构建入栽体pGEM-T Easy中,利用载体通用引物M13F和M13R结合片段特异引物进行菌液PCR反应.用PCR产物电泳结果来筛选阳性克隆并鉴定目的片段插入方向,同时能有效对短插入片段重组子进行筛选与鉴定.最终以DNA测序结果来验证,与测序结果一致,显示通用引物PCR方法对阳性克隆的筛选和鉴定优于传统酶切和普通PCR鉴定方法,能够弥补传统方法的不足,且简便快速,可作为筛选和鉴定阳性克隆的有效手段.     

棉铃虫核多角体病毒基因库及其物理图谱

本文报道棉铃虫核多角体病毒DNA经限制性内切酶BamHI酶解,琼脂糖凝胶电泳分离,得到大小不同的11种片段。所得片段与BamHI酶解的pBR_(322)质粒DNA进行体外重组并转化大肠杆菌LE392菌株。根据菌落杂交和插入片段的分子量等鉴定,证明获得11个插入了病毒DNA片段的重组质粒,但其中两个大片段克隆的分子量比原片段小。通过限制酶EcoRI和BamHI酶解片段的交叉吸印杂交及用~(32)p标记的克隆片段与病毒DNA酶解片段杂交等方法,构建了病毒基因组BamHI的物理图谱。杂交结果表明,病毒基因组主要由独特的序列组成。     

水稻核基因组DNA的YAC克隆和鉴定

将EcoRI部分消化的水稻(Oryza sativa L.)细胞核高分子量DNA电泳分部,回收大于200kb的片段,与内切酶消化过的酵母人工染色体(YAC)双质粒载体pJs97。pJS98DNA连接,转化酵母YPH252感受态原生质球,用ura^-,TrP^-双选择培养基直接筛选转化子,已获得2 000多个克隆。转化子DNA的southern杂交显示插入片段在200～820kb范围。     

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA片段的分子克隆及其鉴定

使用限制性核酸内切酶 BamHI 将油桐尺蠖核型多角体病毒(Buzura SuppressariaNuclear Polyhedrosis Virus。简称 BsNPV)DNA 切为9个片段。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳洗脱,将其酶切片段与 BamHI 切割后的质粒 pBR_(322)重组,转化大肠杆菌,经抗菌素筛选、电泳分折和菌落杂交3种方法证明了插入子的存在,从而表明油桐尺蠖核型多角体病毒 DNA BamHI 片段已经克隆。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

水稻线粒体26S rRNA基因在大肠杆菌JM101中的克隆及分子鉴定

用BT型水稻喜峰A黄化苗为材料,按本实验过去报道经修改后的方法提取线粒体DNA,经EcoR1完全酶切后,随机克隆到pUC19载体上,转化大肠杆菌,在含氨苄青霉素(50μg/m1)和X-gal的LB固体平板上筛选白色转化子。随机提取重组子DNA,以玉米26S rRNA基因为探针,经Southern分子杂交鉴定,一个插入1.3kb水稻线粒体DNA片段的重组质粒杂交结果为阳性,并将这个含有26S rRNA基因片段的重组质粒命名为pXMT1。     

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.     

一种快速鉴定重组转化子的方法

对于重组DNA的鉴定往往需要两至三天甚至更长的时间。尤其是对那些既无筛选标志,插入DNA片段又与原载体大小差别甚大的重组转化子的鉴定,更加耗时费力。该研究利用PCR方法,建立了一种从转化子菌落中直接鉴定重组DNA的方法,使这一过程缩短为半天,减少了不必要的人力和物力耗费。     

Split-marker 重组技术构建泛素C 末端水解酶基因缺失菌株

目的:对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)泛素末端水解酶(creB)基因进行敲除。方法:通过氨基酸序列分析软件初步分析烟曲霉CreB蛋白结构.利用split-marker重组技术构建重组片段,并通过PEG-原生质体方法对烟曲霉野生菌株进行转化,采用PCR方法对转化子进行筛选,最后选取初步筛选的转化子进行测序鉴定。结果:结构分析显示烟曲霉CreB蛋白具有泛素特异蛋白酶(ubiquitin-processing protease)UBP亚家族六个结构域。本实验构建了转化片段并转化,在抗性平板中获得了25个Hyg抗性转化子,进一步采用PCR方法筛选到20个转化子,最终通过测序分析获得一株creB基因缺失菌株。结论:Split-marker重组技术是对烟曲霉creB基因进行敲除的快速有效的方法。获得的creB缺失菌株可用于基因功能研究。     

转座子Tn233(CH)分子量的测定

转座子Tn233(CH)带有str sul抗性基因,最早是在痢疾杆菌的抗药质粒DR233(Tc~r Cm~r Sm~r Su~r)中发现的。现在通过菌株间的配对,将插入了Tn233(CH)转座子的质粒R144drd3::Tn233(CH)转移到E·coli C600/pBR322(Ap~r、Tc~r)细胞中,组成两种质粒共存的菌株。从此菌株中提取出质粒DNA,用转化方法使它转移到E.coli C600菌株,再从所得到的转化子中用复印方法筛选出Tn233(CH)转座到pBR322质粒的转化子E.coli C600/pBR322::Tn233(CH),然后提出此质粒DNA,经限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ等酶切后,在琼脂糖凝胶平板与聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳分析,分别以BamHⅠ与EcoRⅠ双重酶解的λDNA、HindⅢ酶解的T5DNA、HaeⅢ酶解的M13 DNA与HaeⅢ酶解的pBR322 DNA作为泳动的标记,计算出质粒酶解片段的分子量,用此方法算出各片段分子量的总和为15.93×10~6道尔顿,此即为所求的pBR322::Tn233(CH)分子量,将此值减去pBR322的分子置2.87×10~6道尔顿,得到Tn233(CH)的分子量为13.06×10~6道尔顿。电泳结果还表明在Tn233(CH)DNA分子上,BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ分别有5、9、1、6、2个切点数。     

环状芽孢杆菌α—羟基—γ—氨丁酰酰化酶基因的克隆和表达

本文报道了以质粒pUB110为载体,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)作为受体菌,对丁酰苷菌素产生菌(Bacillus circulans NRRL-B3312)总DNA进行了鸟枪克隆,在所获得的转化子中,No.733转化子经薄层层析,生物显迹和质谱分析表明,它具有将卡那霉素A生物转化成为丁胺卡那霉素的能力,说明该转化子所含重组质粒pUBC733的插入片段中含有a-羟基-r-氨丁酰(HABA)酰化酶基因,HABA酰化酶基因已经在枯草芽孢杆菌中获得了克隆和表达。该重组质粒分子量为7.3kb,插入片段为2.8kb,经Southern分子杂交确证此片段确来源于环状芽孢杆菌,已构建了该质粒限制性内切酶图谱。     

红色荧光蛋白在丝状真菌里氏木霉中的表达

目的:建立红色荧光蛋白在里氏木霉中的表达方法,为深入研究里氏木霉中纤维素酶的合成机理打下基础。方法:采用PCR方法分离了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ(CBHⅠ)的启动子(Pcbh1)和终止序列(Tcbh1),将这两个片段与红色荧光蛋白(DsRed)的基因连接,得到Pcbh1-DsRed-Tcbh1表达盒。用此表达盒和质粒pAN7-1对里氏木霉QM9414的原生质体进行共转化,并用含100μg/ml潮霉素B的选择性平板进行筛选。结果:经筛选得到20个抗性转化子,在乳糖的诱导下有5个转化子可以表达红色荧光蛋白。对插入片段进行了扩增和序列测定,结果表明DsRed通过同源重组整合到了转化子的基因组DNA上,并处于cbh1启动子的下游。结论:通过cbh1启动子可以实现红色荧光蛋白在里氏木霉细胞内的稳定表达。     

生米卡链霉菌丙酰化酶基因定位及其核苷酸序列测定

我们已往的工作已经确定在重组质粒ｐＩＪＭ９中,生米卡链霉菌来源的４．１６ｋｂ插入ＤＮＡ片段带有丙酰化酶基因,为了进一步确定该基因在４．１６ｋｂ插入片段中的位置,我们以ＢａｍＨＩ对ｐＩＪＭ９进行酶切,在此基础上进行缺失重组亚克隆,在所获得的转化子中,Ｎｏ．５转化子含重组质粒ｐＩＪＭ９５,分子量为５．０ｋｂ,插入ＤＮＡ片段为０．５３ｋｂ,以Ｎｏ．５转化子对螺旋霉素进行生物转化实验,其转化产物经薄层层析     

莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库的构建和鉴定

目的:构建莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库,以便研究与莱芜猪优良性状相关的基因。方法:采用改良的异硫氰酸酸胍一步法制备总RNA;利用SMART技术,以PrimeScript反转录酶逆转录合成第一链cDNA,通过LD-PCR扩增获得cDNA双链;经蛋白酶K消化和CHROMA SPIN-400柱分级分离后,收集500 bp以上的cDNA片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,建成原始文库;随机挑取单菌落,用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定重组子插入片段大小。结果:经鉴定,原始文库的滴度为2.8×105 cfu/mL,重组率约为98%,插入片段大小为0.5～2 kb,平均插入片段长度大于1 kb。结论:建立的cDNA文库质量良好,可以用于目的基因的筛选。     

细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究

基因组文库是进行分子克隆和基因结构与功能研究的基础,完整覆盖的基因组文库的构建,使基因组任何DNA片段的筛选和获得成为可能.细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)与其它载体系统相比具有转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收,高覆盖率、稳定性强,并且具有易分离和操作等特性等优点而被广泛应用.作为物种保护策略的重要部分,构建我国濒危动植物品种基因组BAC文库,对于其遗传资源的保护和研究具有非常重要的作用.在查阅大量国内外相关资料的基础上,就BAC基因组文库构建过程中栽体的制备、高分子量DNA的制备、大片段DNA的回收、连接与电击转化、基因组BAC文库质量鉴定等几个重点、难点问题进行了详细的论述和分析,对于构建高分子量插入片段、高覆盖率和稳定性的基因组文库提供理论基础与技术支撑.     

基于XcmI识别序列的T载体的构建及连接PCR片段的优化

目的:构建基于Xcm I识别序列的T载体并对与其连接的PCR片段进行优化。方法:首先将5’和3’端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 c DNA定向克隆至p CDNA3.0表达载体中,再用Xcm I酶切得到基于p CDNA3.0载体骨架的T载体,为提高T载体与DNA片段的连接效率,在DNA片段PCR扩增前将其引物进行磷酸化并在PCR结束后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理,分别将长度为312 bp和1 329 bp的PCR片段T载体连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率。结果:经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的 DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理也能够显著增加连接效率。结论:克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等实验条件的限制,可为T载体的常规制备并与目的片段进行高效地连接提供了新的线索。     

小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化

目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。     

Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针与大熊猫基因组酶切片段杂交,捕获400—600bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pGEM-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。应用γ^32P标记的探针筛选文库,从2880个转化子中获得了260个阳性克隆。对54个序列进行了测序,并成功地设计了大熊猫微卫星引物37对。该方法能有效提高筛选微卫星标记的效率。     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。     

山羊瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析

从山羊瘤胃液中提取混合微生物DNA,经BamHI部分酶切得到50kb～800kb的DNA片段后,将其连接到pCCIBAC载体上,转化E．coliEPI300,建立山羊瘤胃微生物BAC文库。经RFLP鉴定分析,该文库12672个克隆,平均插入片段为6lkb。该文库的构建为后续新型基因的筛选提供了材料,为进一步研究山羊瘤胃微生物奠定了基础。