重组人VEGF165的表达纯化及单抗的初步筛选

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是抑制肿瘤生长和转移的重要靶点。为获得抗VEGF单抗细胞株,构建了rhVEGF₁₆₅工程菌,并利用复合自动诱导获得高效表达。经纯化获得高纯度rhVEGF₁₆₅蛋白,经检测具有促人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖活性,其EC₅₀为2.4ng/ml。免疫小鼠,获得了3株能稳定分泌抗VEGF单抗的杂交瘤细胞株,为开发VEGF治疗性单抗提供了重要基础。     

VEGF受体KDR胞外区基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

VEGF(血管内皮细胞生长因子,Vascular Endothelial Growth Factor)是刺激内皮细胞增殖和新生血管形成的最重要因子,与多种实体瘤的生长和转移密切相关。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常有前景的课题。将VEGF受体KDR胞外区前三个Loop 969碱基对的cDNA片段克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI,与杆状病毒表达载体Bacmid同源重组后,转染昆虫细胞SF9,获得重组杆状病毒并证明了目的基因的高效表达。经Western blot证实表达产物的特异性。经ELISA和体外生物学活性检测表明表达产物可阻断VEGF的生物学活性,抑制鸡胚CAM血管的生长。     

抗人VEGF受体Ⅱ基因Ⅲ区单链抗体基因的构建和表达

采用RT-PCR技术从分泌抗人血管内皮生长因子受体Ⅱ（kinase insert domaincontaining receptor,KDR）基因Ⅲ区单克隆抗体Ycom1D3的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L基因之间引入柔性短肽（Gly₄Ser）₃,体外构建Ycom1D3单链抗体基因Ycom1D3-ScFv）,将其克隆至pAYZ表达载体,在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,Ycom1D3-ScFv在E.coli 16C9中获得表达,重组蛋白的相对分子量为30kD,与预期结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,TALON 金属亲合层析基质（TALON metal affinity resin）纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实该单链抗体可与人脐静脉内皮细胞结合,保留了鼠源单抗与KDR抗原的特异性结合活性。抗KDRⅢ单链抗体基因Ycom1D3-ScFv的成功构建和功能性表达为靶向诊断治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。     

短肽库中VEGF受体拮抗剂的筛选及生物学活性鉴定

为获得可溶性血管内皮细胞生长因子受体 (s VEGFR,soluble VEGF receptor)的拮抗剂 ,以固相化可溶性 VEGF受体 s Flt- 1和 s KDR通过生物淘选筛选噬菌体十二肽库 .采用 ELISA及竞争性 ELISA筛选阳性克隆 ,12 5I- VEGF竞争性放射免疫吸附实验进一步鉴定阳性克隆的体外结合活性 .经过 3～ 4轮生物淘选的短肽库有明显富集 .初筛后约 3%的噬菌体克隆可同时结合相应的可溶性受体及人脐静脉内皮细胞 .其中 6个克隆与内皮细胞的结合 ,可以部分地被变性复性处理的原核表达血管内皮细胞生长因子 (VEGF)竞争抑制 .4个噬菌体克隆可竞争性抑制 12 5I- VEGF与可溶性受体的体外结合反应 .两个 KDR阳性克隆 K2 37与 K93可在体外抑制内皮细胞的增殖 .克隆K2 37与 F90可抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管形成 .阳性克隆可作为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂 ,具有良好的应用前景 .     

逍遥丸合六味地黄丸对原因不明月经过少子宫内膜细胞ER、VEGF和KDR表达影响

探讨逍遥丸合六味地黄丸治疗原因不明月经过少的机理.原代培养原因不明月经过少病人的子宫内膜,采用免疫细胞化学进行细胞鉴定.空白对照组,高剂量组,中剂量组,低剂量组,雌激素组.免疫蛋白质斑迹法观察子宫内膜细胞的雌激素受体(ER)、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(KDR)表达改变.逍遥丸合六味地黄丸能增强子宫内膜细胞的ER、VGER和KDR表达.逍遥丸合六味地黄丸可能通过提高子宫内膜组织中ER、VEGF和KDR治疗原因不明月经过少.     

外源性VEGF对结肠癌细胞SW480蛋白质变化的影响

利用RT-PCR发现结肠癌细胞存在血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)的表达,随后采用外源性VEGF对结肠癌细胞SW480进行体外刺激,流式细胞仪检测到结肠癌细胞刺激后快速进入分裂期,同时提取VEGF作用前后的结肠癌细胞总蛋白,蛋白质组学研究,发现存在明显的蛋白质变化,其中鉴定出10个差异蛋白质.提示外源性VEGF可以促进结肠癌细胞增殖并对肿瘤细胞蛋白质组产生明显的影响.     

小鼠天然可溶性VEGF受体基因sflt-1的克隆及鉴定

 可溶性血管内皮细胞生长因子受体 (sFlt 1 )与膜表面受体Flt 1竞争结合血管内皮细胞生长因子 (VEGF) ,并且与膜表面受体Flt 1及KDR形成异源二聚体 .完全阻断VEGF的生物学活性 ,除与sFlt 1的结合部位结构域有关外 ,还与整个蛋白质分子的高效分泌表达有关 .而蛋白质分子的高效分泌表达与蛋白质在细胞内高尔基体及内质网的加工密切相关 ,基因工程重组可溶性受体由于一些尚未明了的原因 ,往往不能高效表达 ,从而大大影响了其应用价值 .利用RT PCR技术从胚胎小鼠中扩增出天然可溶性VEGF受体基因sflt 1 ,克隆于pcDNA3载体中 ,在COS 7细胞中短暂表达 ;并克隆至pET42b载体中 ,经IPTG诱导后 ,可大量稳定表达与His Tag形成的融合蛋白 ,经HisNi柱纯化 ,可特异性结合VEGF .可溶性受体sFlt 1在肿瘤组织的高效表达可有效阻断新生血管的形成 ,从而为肿瘤的治疗探索一种方法 .     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区1-3 loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母载体中,构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His⁺Mut^s表型转化子,经摇瓶培养,1%甲醇诱导表达4 d后,SDS-PAGE结果显示,培养上清中Flt1(13)表达量达总蛋白的30%以上。ELISA及Western blot实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合VEGF的能力和抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖功能。     

血管内皮生长因子受体的结构与功能

血管内皮生长因子(VEGF)受体是存在于血管内皮细胞,介导内皮细胞增殖分化的跨膜受体.研究较多的有两种VEGF特异受体:Flt和KDR.Flt和KDR的基因结构及染色体定位已基本确定,这二者均属RTK Ⅲ型受体,结构相似.细胞外区均有7个类似免疫球蛋白结构,细胞内区催化域均有酪氨酸激酶插入区.当VEGF与受体结合时,引起受体自身的磷酸化,发生细胞内反应.在血管发生与生长、创伤修复、炎症、肿瘤和某些血管疾病中起重要作用.     

顺铂联合VEGF抗体对食管癌移植瘤小鼠免疫调节以及癌细胞增殖和肺转移的影响

摘要 目的：研究顺铂联合血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）治疗对食管癌移植瘤小鼠免疫功能、癌细胞增殖以及肺转移的影响。方法：30只BALB/c小鼠通过皮下注射食管癌移植瘤模型。一周后,30只食管癌移植瘤模型小鼠被随机均分为3组,即模型组、顺铂组和联合组。模型组不进行治疗,顺铂组腹腔注顺铂治疗,联合组腹腔注射顺铂联合尾静脉注射VEGF抗体进行治疗,共治疗7周。比较各组小鼠体重,食管癌移植瘤体积和重量,卵巢癌细胞肺组织转移结节数、癌细胞转移面积和转移病灶总数,以及食管癌移植瘤外周血CD4⁺、CD8⁺以及CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞比例。结果：（1）顺博组和联合组小鼠体重均显著高于对照组,而联合组小鼠体重显著高于顺铂组（P<0.05）;（2）顺铂组和联合组小鼠CD4+和CD8+细胞比例均显著低于对照组（P<0.05）,而CD4⁺/CD8⁺却显著高于对照组（P<0.05）;（3）联合组小鼠CD4⁺和CD8⁺细胞比例均显著高于对照组（P<0.05）,而CD4⁺/CD8⁺却显著低于顺铂组（P<0.05）;（4）顺铂组和联合组小鼠食管癌肿瘤组织体积和重量,肺转移结节数、转移面积和转移病灶数均显著低于对照组（P<0.05）,而联合组小鼠显著低于顺铂组（P<0.05）。结论：VEGF抗体可以显著增强顺铂在体内对食管癌的抗癌特性,并有助于增强食管癌移植瘤小鼠免疫功能、抑制癌细胞体内增殖和肺部转移。     

外周血CTC、VEGF的水平与晚期非小细胞肺癌临床特征及化疗疗效关系的研究

摘要 目的：探讨外周血循环肿瘤细胞（CTC）、血管内皮生长因子（VEGF）的水平与晚期非小细胞肺癌临床特征及化疗疗效的关系。方法：选取我院2017年1月到2020年1月收治的80例晚期非小细胞肺癌患者作为研究对象,所有患者均采取一线方案化疗,分析外周血CTC、VEGF的水平与患者的年龄、性别等的关系,并对晚期非小细胞肺癌化疗疗效进行单因素与多因素COX分析。结果：CTC、VEGF与不同性别、年龄患者和TNM分期无明显关系（P＞0.05）,与淋巴结转移、肿瘤分化程度、肿瘤大小有关（P＜0.05）;80例患者中,客观缓解率（ORR）为51.25 %（41/80）,疾病控制率（DCR）为71.25 %（57/80）;淋巴结转移、肿瘤分化程度、CTC和血清VEGF水平为晚期非小细胞肺癌患者ORR、DCR的影响因素（P＜0.05）;COX分析分析表明：肿瘤中、低分化、CTC阴性、VEGF降低为晚期非小细胞肺癌化疗ORR和DCR提升的独立影响因素（P＜0.05）。结论：外周血CTC、VEGF检测对于晚期非小细胞肺癌化疗近远期疗效评估具有重要价值,属于预后独立影响因素。因此,CTC、VEGF可作为晚期非小细胞肺癌的预后及疗效判断的指标。     

VEGF重组质粒pcDNA/V的构建及其在大鼠急性心肌缺血模型中的表达

构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)真核表达载体,并研究其在细胞水平和大鼠急性心肌梗死动物模型中的表达。利用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增人VEGF165基因,构建真核表达载体pcDNA/V。应用脂质体介导的基因转移技术,将pcDNA/V转染至人胚肾细胞(293细胞)中,经G418筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆。ELISA、Westernblot检测证实重组质粒pcDNA/V能在293细胞中高效表达外源VEGF基因,鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验证实表达产物具有促血管生成的活性。进一步的体内表达研究,建立大鼠急性心肌梗死模型,将重组质粒pcDNA/V、空质粒pcDNA3.1( )分三点注射于梗死交界处心肌内,四周后取材。经免疫组化染色检测,pcDNA/V组在梗死交界区有VEGF阳性表达;电镜观察显示,pcDNA/V组在梗死交界处心肌细胞间有大量毛细血管内皮细胞增生。实验结果表明成功克隆了人VEGF165基因,构建了其真核表达载体。体内、外表达研究证实重组质粒的表达产物具有促血管生成的生物学活性,为VEGF基因治疗缺血性心肌病的研究提供实验基础。     

重组人VEGF可溶性受体的表达纯化及结合性质初探

目的:表达优化的血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1(VEGFR1)胞外区第2个类免疫球蛋白结构域(VEGFR1D2)和VEGF受体2(VEGFR2)胞外区第3个类免疫球蛋白结构域(VEGFR2D3)与人IgG1 Fc片段的融合产物VEGF-Trap2,探讨该产物与人源VEGF165(hVEGF165)之间的亲和力。方法:将优化的目的基因VEGFR1D2/R2D3连接到真核表达载体pIRES2-EGFP-Fc中,转染CHO-K1细胞并筛选高表达目的蛋白VEGF-Trap2的细胞系,亲和纯化VEGF-Trap2蛋白,通过非竞争性ELISA及生物膜干涉技术检测VEGF-Trap2与hVEGF165之间的亲和力。结果:DNA测序表明真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2序列正确;获得表达VEGF-Trap2的细胞系;非竞争性ELISA实验中,VEGF-Trap2与hVEGF165功能性亲和常数达到1.86×107L/mol;生物膜干涉实验中,hVEGF165与VEGF-Trap2的平衡解离常数达到3.13×10-9mol/L。结论:构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF-Trap2并在CHO-K1细胞中稳定表达,重组蛋白VEGF-Trap2与hVEGF165有较高的亲和力,提示其可用于阻断VEGF信号传导途径,为该蛋白进一步的体外及体内实验奠定了基础。     

抗血管内皮生长因子受体2双价单链抗体的构建表达及其活性研究

为了竞争性抑制血管内皮生长因子(VEGF)与其受体(VEGFR-2)的结合,构建表达了能够与VEGFR-2胞外3区(KDR3)特异结合的双价单链抗体(bivalent single-chain Fv,BsFv),并鉴定其生物活性。以KDR3特异结合单链抗体AK404(scFv AK404)基因为模板,设计引物引入中间连接肽(G₄S)₃连接两个scFv片段,将其克隆入原核表达载体pET22b,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物依次经过镍柱亲和层析纯化和透析复性;基于生物膜层表面干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)技术的体外亲和力监测实验和VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验鉴定表达产物与KDR结合的活性。酶切鉴定和DNA测序结果表明BsFv构建成功;SDS-PAGE显示37 ℃下1 mmol/L IPTG诱导细菌6 h获得包涵体,经镍柱亲和层析纯化和透析复性得到纯度为90%的BsFv;经Western blotting鉴定为目的蛋白;体外结合实验表明:BsFv特异性结合KDR胞外3区的亲合力约为单价抗体AK404的2倍;内皮细胞增殖抑制实验表明:BsFv可剂量依赖性地抑制HUVEC细胞增殖,且其抑制效果强于AK404。上述结果表明:BsFv在抗血管生成活性方面比其scFv具有明显优势,为进一步用于抗血管生成抗肿瘤治疗和肿瘤诊断奠定了基础。     

人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达与配体结合活性的鉴定

血管内皮生长因子受体(VEGFR)是血管内皮生长因子的特异性受体,VEGFR-2在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用.在大肠杆菌中实现可溶性的人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区的表达,并鉴定其与配体结合的活性.采用重叠PCR的方法合成人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区基因,将该基因与高效表达载体pET-32a重组,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,表达产物依次经过CM阳离子交换树脂和镍柱亲和层析纯化.利用ELISA法和体外抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞增殖实验检测表达产物与配体结合的活性.SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以可溶性Trx-KDR3融合蛋白表达于胞质,30℃时1 mmol/L IPTG诱导细菌5 h融合蛋白表达量约占胞质可溶性总蛋白的20%,经CM阳离子交换树脂和镍柱亲合层析纯化得到纯度为95%的产物,Western blotting鉴定是目的蛋白.ELISA和体外HUVEC细胞增殖实验显示,表达产物具有特异性结合hVEGF165的活性,且该作用呈一定的浓度依赖性.具有配体特异性结合活性的可溶性人血管内皮生长因子受体KDR胞外3区成功表达,为靶向血管抗肿瘤治疗和相关抗体的研究奠定了基础.     

GM3抑制人白血病J6－2细胞肌醇磷脂代谢循环

采用无载体 ³²P和[ ³H]肌醇标记磷脂,观察了促分化剂神经节苷脂GM₃对人单核样白血病J6-2细胞肌醇磷脂代谢的影响.GM₃抑制[ ³²P]Pi和[ ³H]肌醇掺入J6-2细胞磷脂酰肌醇(PI),促进[ ³²P]Pi和[ ³H]肌醇掺入磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP₂),抑制[ ³²P]Pi掺入磷脂酸(PA),抑制[ ³H]肌醇掺入三磷酸肌醇(IP₃).GM₃的上述作用均为浓度依赖性的,随GM₃浓度的提高而增强.上述结果表明,GM₃抑制J6-2细胞的肌醇磷脂代谢循环.     

VEGF受体KDR结合区的克隆与表达

KDR是血管内皮生长因子(VEGF)的主要受体之一,它在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用.为了获得人重组的有VEGF结合活性的KDR,通过RT-PCR从人胎儿脐静脉内皮细胞（EC）扩增出编码KDR胞外Ⅰ～Ⅳ区片段,将其克隆在谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白表达载体pGEX2T中,并在大肠杆菌中获得稳定表达.表达的融合蛋白GST-KDR以包涵体形式存在,其分子质量约66 ku左右.经碱变性法大量提取,及制备胶电泳获得纯化的KDR,为进一步的研究奠定了基础.     

人VEGF165基因转染成人成肌细胞的实验研究

目的：将人血管内皮生长因子165（hVEGF165）导人原代离体成肌细胞,观察该细胞hVEGF分泌情况,探讨成人自体转基因成肌细胞移植的可行性。方法：采用两步消化法对成人骨骼肌组织消化获取相对较纯的成肌细胞,通过差速贴壁法进行进一步的纯化。以脂质体转染法将pcDNA3．1-hVEGF165导入成肌细胞,通过RT—PCR、ELISA和Western-blot进行hVEGF165定量检测,MTT测定和Mile’s实验检测VEGF165的生物学活性。结果：转基因细胞经RT—PCR扩增出一条VEGF的特异性泳带,ELISA显示转基因细胞培养上清VEGF浓度分别达到18．92±1．77rig／mL、19．04±2．15ng／mL,Western blot检测转基因成肌细胞上清均检测到VEGF蛋白特异性的杂交带,MTT显示转基因细胞上清明显促内皮细胞增殖,Mile’s实验显示转基因细胞上清明显增加毛细血管通透性。结论：质粒pcDNA3．1-hVEGF165能成功转入成人成肌细胞,转基因细胞能分泌有生物活性的VEGF165蛋白。     

可溶性VEGF受体Flt-1的基因克隆及其活性产物在原核中的表达

可溶性血管内皮细胞生长因子受体 ( Flt- 1 )具有受体拮抗剂作用 ,可竞争结合血管内皮细胞生长因子 ,( VEGF)并与其膜表面受体 Flt- 1及 KDR形成异源二聚体 ,最终阻断 VEGF的生物学活性 .利用 RT- PCR技术从人脐静脉内皮细胞扩增出 Flt- 1胞外 ～ 区 c DNA片段 ,通过基因重组将该片段克隆于谷胱甘肽转移酶 ( GST)融合蛋白表达载体 PGEX2 -T中 ,连接产物转化大肠杆菌XL1 - blue,经 IPTG诱导可获大量稳定表达的 Flt- 1 - GST融合蛋白 .该表达产物经变性复性处理后 ,可特异性结合 12 5 - VEGF.大量具有活性的可溶性 Flt- 1的获得有助于新的抗肿瘤血管形成方法的探索 .     

三氧化二砷诱导早幼粒细胞白血病细胞线粒体基因突变与细胞凋亡

提取用2 μmol/L As2O3对NB4细胞株和APL体外干预及用0.16 mg·kg^-1·天^-1 As2O3静脉输注治疗干预前后的白血病细胞线粒体基因, PCR扩增后直接测序, 干预前后的序列对比分析, 同时流式细胞仪对细胞凋亡率测定. 分析了As₂O₃在体内和体外作用对原代急性早幼粒细胞白血病细胞(APL)和NB4细胞株的线粒体基因(mtDNA)非编码区D-loop的基因突变与细胞凋亡的关系. 研究发现, As₂O₃处理后mtDNA的D-loop区基因突变位点数目较处理前显著增多, mtDNA的D-loop区基因突变率与细胞凋亡率呈正相关关系, 相关系数r_NB4-As2O3=0.973818,r_APL-As2O3 =0.934703. 突变类型包括转换、颠换、插入和缺失. 本实验仅是初步研究, 尚未发现As₂O₃对mtDNA的D-loop区稳定的突变位点和突变规律. 结果显示, As₂O₃体内外干预均能加剧急性早幼粒细胞白血病细胞mtDNA的D-loop区基因突变, 并与其促凋亡作用呈正相关, mtDNA的D-loop区可能是砷剂治疗白血病的一个靶点.