虎杖原生质体分离纯化及电融合初步研究

以野生虎杖根状茎芽为外植体诱导虎杖愈伤组织,选取生长状况良好的愈伤组织作为原生质体分离材料,通过L16（44）正交试验对虎杖原生质体分离条件进行优化.结果表明：1.4%纤维素酶R-10,0.1%果胶酶,17%甘露醇的酶液,酶解时间7h,虎杖原生质体分离效果最好.在80r/min振荡分离后虎杖原生质体得率为46.2%.以800r/min的离心速度纯化,纯化的原生质体得率为43.8%,其中原生质体的成活率为75%.通过对虎杖原生质体进行融合,原生质体的融合率为20.2%.     

黑曲霉原生质体电融合研究

以NTG和UV分别对生淀粉糖化酶菌株——野生型黑曲霉N 11,N一16(Aspergillusniger)进行诱变处理获Lys^-和Arg^-两类营养缺陷型。采用纤维素酶和蜗牛酶复合酶处理其菌丝并探讨了酶浓及菌龄等因素对原生质体形成和再生的影响。以BAEKON-2000型基因转移仪将上述营养缺陷型进行原生质体电融台处理。产生高融合率的最佳参数为：脉冲幅度4．5kV,脉冲数32,脉宽62．5μs,电激时间0.2s,距离3mm,周期数10。融合率可达60％。经连续传代7次获得4株稳定的融合子,经孢子体积,核DNA含量,生长速度测定证明上述融合子是种内杂合二倍体。以PFA处理得稳定的单倍体分离子。     

柑桔原生质体电融合研究进展

柑桔原生质体电融合研究进展刘继红︵华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室武汉４３００７０︶柑桔是世界四大水果之一,也是我国南方最为重要的一种水果。由于柑桔是多年生木本植物,童期长,遗传上高度杂合,一些主栽品种雄性败育（如温州蜜柑）或／和雌性败育（如...     

茶树叶肉原生质体的分离与纯化

以茶树幼苗叶片为材料,分析了甘露醇浓度、不同酶液组合、酶解时间等因素对叶肉原生质体分离及2种高密度分离液对原生质体纯化的影响。结果表明,叶片在含0.6 mol/L的甘露醇、1.5%的纤维素酶和2.5%的离析酶的酶解液中黑暗酶解16~18 h,叶肉原生质体的分离效果最好。此外,研究发现原生质体在10%的甘露醇与25%的碘克沙醇界面处聚集形成了一条带。     

普通番茄叶肉原生质体和多毛番茄茎尖原生质体的电融合

普通番茄叶肉原生质体和多毛番茄茎尖原生质体在一交变电场中(正弦波;1mHz,200v/cm)可发生双向电泳而随机排列成串。再附加单个直流方波脉冲,可诱导相邻原生质体的融合,适宜的融合脉宽为40μs,电压幅度为3000v/cm。最高融合率可达57%。培养经电融合处理的原生质体,观察到了少数原生质体的第1次分裂。     

坛紫菜和条斑紫菜的原生质体电融合

用日本岛津公司生产的电融合装置(SSH－2),进行了坛紫菜和条斑紫菜的原生质体融合试验。探讨了不同的电刺激条件、融合缓冲液种类以及蛋白酶的前处理与细胞融台的关系。其结果是,高频电压30一35V,印加时间25—30s;脉冲电压300—350V,印加时间60μs,及添加3m mol／L Ca²⁺、Mg²⁺的融合缓冲液可使融台率达到21—31％。蛋白酶的前处理对细胞融合有明显的效果。融合细胞培养7天后产生细胞壁,4l天长成多细胞团。     

淋巴细胞分离液在植物细胞原生质体分离纯化中的应用

本文报道了用淋巴细胞分离液分离纯化植物原生质体的实例,并就其方法原理和运用技巧进行了讨论。     

放线菌种间原生质体电融合育种

以龟裂链霉菌(S．Rimosus,Otc^r,Sm ^s)和灰色链霉菌(S．Griseus,Sm^r,Otc^s)为原始出发菌株,经NTG诱变处理,获得前者(Asp^-)和后者(cys^-)营养缺陷型突变株,制成10⁹个／m1等量原生质体混合液,在岛津细胞融合装置SSH—C¹¹融合槽(电极间距为0．5mm)内,以频率lMHz、强度800V／cm的高频交流电场作电介质,电泳15s形成原生质体珠串,旋即施加电场强度6 kV／cm、短时程20μs的直流高压方形电脉冲触发原生质体融合,在R₃再生培养基上选取34971个菌落,移植于双抗基本培养基,检出四个双抗原养型融合子。它们具有亲株的优良生物学特性,生长速度较快,产素能力大,抗菌活性高。生物显影结果表明,它还产生两个亲株所不具有的抗菌活性物质。     

虎杖的组织培养与快速繁殖

以虎杖茎段、叶柄、叶片为外植体探讨了愈伤组织诱导、分化和植株再生的条件,筛选出茎段生长培养基为1/2MS+BA1.0mg·L-1+KT0.5mg·L-1+NAA0.2mg·L-1,茎段、叶柄和叶片外植体愈伤组织诱导培养基为MS+BA1.0～2.0mg·L-1+KT0.2～0.5mg·L-1+NAA0.2～0.5mg·L-1或MS+BA2.0～3.0mg·L-1+KT0.2～0.5mg·L-1+2,4-D0.5mg·L-1;丛生芽诱导培养基为MS+BA2.0mg·L-1+KT0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+LH1000;不定根及根状茎诱导培养基为1/2MS+IBA0.2mg·L-1.     

虎杖根茎中蒽醌类成分的体外抗氧化活性

采用超声波提取法用体积分数80%乙醇对虎杖(Reynoutriajaponica Houtt.)根茎中的蒽醌类成分进行粗提,并利用D101大孔吸附树脂对粗提液进行纯化.以Vc为阳性对照,采用体外动物实验研究了虎杖根茎中蒽醌类成分对小白鼠肝组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活力及对H2O2诱导的MDA含量和红细胞氧化溶血的影响,并采用化学模拟体系分析了其对DPPH·自由基的清除能力、对Fe3+的还原能力以及与Fe2+的螯合能力.结果表明:虎杖根茎中蒽醌类成分含量丰富,粗提物含量达到55.86 mg·g-1,纯化后含量达到44.77 mg·g-1.质量浓度l0、20、30和40μg·mL-1的蒽醌类成分可显著增强GSH-px活力、降低由H2O2诱导产生的MDA含量,并对H2O2诱导产生的红细胞氧化溶血有较强的抑制作用;质量浓度2、4、6和8μg·mL-1的蒽醌类成分对DPPH·自由基具有良好的清除能力,质量浓度6、8、12和16μg·mL-1蒽醌类成分对Fe3+具有较强的还原能力,而质量浓度5、10、15和20μg·mL-1蒽醌类成分对Fe2+则具有很强的螯合能力.随质量浓度的提高,虎杖蒽醌类成分及阳性对照Vc的各项抗氧化活性指标均逐渐增强,呈现出明显的量效关系,且虎杖根茎中蒽醌类成分的各项抗氧化指标均优于相同质量浓度的Vc.研究结果显示:虎杖根茎中的蒽醌类成分具有较强的抗氧化活性,不仅能够直接清除过量的自由基,也可以通过增强体内的抗氧化系统以抑制自由基的产生.结合他人研究结果,对虎杖资源的开发利用提出了一些建议.     

UV-C和水杨酸对虎杖叶中白藜芦醇和虎杖苷的诱导作用

以不同叶龄虎杖叶为材料,研究了不同剂量紫外线(UV-C)和10mmol/L水杨酸(SA)处理对叶中白藜芦醇和虎杖苷含量的影响。结果显示:2.4kJ/m2UV-C照射并经暗处理36h后可使虎杖嫩叶中白藜芦醇含量增加近1倍,暗处理24h后虎杖苷含量提高了30%以上,但是老叶中两者含量没有显著变化。SA处理48h后,嫩叶中白藜芦醇的含量提高约5倍,同时虎杖苷的含量下降了60%并且伴随着一个新成分的产生;老叶中白藜芦醇提高约2倍,虎杖苷的含量则没有显著变化。研究表明SA和UV-C对不同叶龄的虎杖叶片中白藜芦醇和虎杖苷合成均有诱导作用,且嫩叶比老叶表现得更为明显。     

博落回、虎杖和黄芩提取物对植物病原菌的抑制作用

研究了博落回(Macleaya cordata)、虎杖(Reynoutria japonica)和黄芩(Scutellaria baicalensis)提取物对三种植物病原细菌和六种病原真菌的抑制作用.结果显示:虎杖提取物对根癌土壤杆菌和番茄疮痂病菌表现出较强的抗细菌活性;博落回提取物表现出较强的抗真菌活性,对供试真菌的半抑制浓度(IC50)在0.04～0.76mg/mL之间.     

虎杖光合生理生态特性日变化研究

用Li-6400便携式光合测定系统对5个虎杖材料的光合生理特性日变化及其与气象因子关系进行了研究。结果表明：（1）虎杖的净光合速率日变化呈‘单峰’型曲线,日最大净光合速率（15．0μmol·m^-2·s^-1）值出现在9：00左右;（2）叶片水压亏缺、气孔导度和蒸腾速率的峰值在同一时间出现（13：00）,胞间CO2浓度不随气孔导度的降低而减小,控制虎杖光合速率因子为非气孔限制;（3）供试5个材料的净光合速率日变化趋势基本一致,并以地栽组培苗的净光合速率最高,而‘贵州凯里’的最低。光合有效辐射对光合特征参数的变化影响最大,且对净光合速率起决定性作用（r-0．534^＊＊）,环境因子主要通过对蒸腾速率、叶片水压亏缺和叶面温度的作用来影响虎杖叶片净光合速率。     

影响虎杖毛状根高频诱导的因素探讨

利用发根农杆菌ATCC15834对虎杖（Reynoutria japonica Houtt．）进行遗传转化,探讨影响其毛状根高频诱导的因素。结果表明：成熟叶片是转化效率较高的外植体,感染10d左右可形成毛状根,平均诱导率为55．66％,诱根密度为4．30。经PCR检测．证实农杆菌Ri质粒中的rolB及tms基因全部转入毛状根中。改良YEB培养液活化菌种后对出根作用小显著;叶片未经预培养而直接进行感染,其出根效果要明显好于经过MS。或利用TDZ预培养处理（P〈0．01）．毛状根平均诱导牢可达到81．84％,诱根密度为7．04;稀释菌液浸泡、超声振荡或微波辐射处理均可促使叶片提前出根．其中以超声处理30s效果最显著（P〈0．01）;感染叶片上表皮向上放置进行共培养有利于毛状根形成。在优化各种转化条件后,虎杖毛状根平均诱导率可提高到97．1％,诱根密度达到11．3。     

凤尾菇和桃红平菇种间原生质体电融合获杂种菌株

以有自然标记的双核风尾菇(Pleurotus sajor-caju)和桃红平菇(P．Rhodophyllus)为出发菌株,以它们携带营养缺陷型标记的单孢菌株为直接亲本,采用BAEKON 2 000基因转移仪进行侧耳属种间原生质体电融合,成功地获得若干株融合体,其中有一株编号为F57的融台体已培育出子实体。比较了融合体F57与亲本的形态、生理、生化和遗传等性状,结果证实,融合体F57是一株新的种间杂种菌株。     

细胞电穿孔与电融合的机理及应用

近十余年来,由于细胞生物学家、分子生物学家、免疫学家与物理学家之间在学术上的相互渗透、共同实验,已经开辟出一个生物物理技术的新领域．它既涉及细胞电磁场效应及其机理的基础研究;同时作为一种新的生物技术,又涉及对分子生物学、细胞生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面的广泛应用．文章综述了本领域的最近进展．     

Electrofusion for the pronuclear transplantation of mouse eggs

The present study was undertaken to determine the efficiency of HVJ treatment and electrofusion for pronuclear transplantation in the mouse. The output voltage and duration of the pulses were fixed to 200 μsec at 10 V or to 150 μsec at 15 V for electrofusion, because the maximum rates of blastomere fusion of 2-cell embryos and development of fused embryos in vitro were obtained under these conditions. Although the proportion of eggs with fused karyoplast (78%) and the fused eggs developed to morulae or blastocysts (67%) was significantly lower than those obtained after HVJ treatment (94% and 94%), the proportion of pregnant recipients and young obtained after treatment of fused eggs was not significantly different between these two procedures. It is advised that electrofusion can be used as a fusogenic procedure for pronuclear transplantation in the mouse in some cases where HVJ cannot be applied.