微小RNA ame-miR-31a和ame-miR-13b在意大利蜜蜂哺育蜂和采集蜂脑部的表达差异

【目的】研究微小RNA ame-miR-31a和ame-miR-13b在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica哺育蜂和采集蜂脑部的表达情况,探索其在蜜蜂哺育蜂和采集蜂行为转变中的调节作用。【方法】利用qPCR分别检测ame-miR-31a和ame-miR-13b在意大利蜜蜂工蜂正常蜂群和同龄蜂群中哺育蜂和采集蜂脑部的表达量。【结果】不论在意大利蜜蜂工蜂正常蜂群中还是在同龄蜂群中,ame-miR-31a在哺育蜂脑部的表达量总是显著高于其在采集蜂脑部的表达量;在正常蜂群中,ame-miR-13b在采集蜂脑部的表达量显著高于其在哺育蜂脑部中的表达量;在同龄蜂群中,ame-miR-13b在年老哺育蜂脑部的表达量极显著高于其在同龄采集蜂脑部的表达量,在年轻哺育蜂脑部与同龄年轻采集蜂脑部的表达量差异不显著。【结论】ame-miR-13b在意大利蜜蜂哺育蜂和采集蜂脑部的表达没有明显规律,而ame-miR-31a总是在哺育蜂脑部高表达,提示ame-miR-31a在蜜蜂哺育蜂和采集蜂行为转变中可能发挥重要的调控作用。     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

过表达和敲减ame-miR-13b对意大利蜜蜂幼虫肠道内基因表达的影响

【目的】微小RNA(microRNAs, miRNAs)在昆虫的繁殖、发育和免疫等重要生命活动的调控过程中扮演关键角色。本研究旨在探究在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫个体水平过表达与敲减ame-miR-13b对其靶基因表达的影响,为深入探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ame-miR-13b的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b及其对照mimic-NC和inhibitor-NC,混入饲料后饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫,每12 h更换一次饲料,连续饲喂6次,以分别过表达和敲减ame-miR-13b;通过RT-qPCR检测过表达和敲减ame-miR-13b后意大利蜜蜂幼虫肠道中ame-miR-13b及其靶基因Ecr, Egfr和P450 18a1的表达量。【结果】与mimic-NC饲喂组相比, mimic-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在意大利蜜蜂4和6日龄幼虫肠道中均显著上调表达;与饲喂inhibitor-NC组相比,inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在4日龄幼虫肠道中下调表达,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调表达。与mimic-NC饲喂组相比,过表达ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr的表达量显著降低,而Ecr和P450 18a1的表达量均显著升高。与inhibitor-NC饲喂组相比,敲减ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr上调表达但不显著,Ecr显著上调表达,而P450 18a1显著下调表达。【结论】通过饲喂法在意大利蜜蜂幼虫个体中成功实现了miRNA的过表达和敲减;ame-miR-13b与Egfr之间存在潜在的负调控关系。     

ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

狄斯瓦螨对意大利蜜蜂工蜂呼吸代谢的影响

【目的】意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称"意蜂")是世界重要的授粉昆虫,对维持生态平衡、提高农产品产量和保障粮食安全至关重要。但受狄斯瓦螨Varroa destructor侵害,全世界的意蜂蜂群每年都受到巨大损失。本研究主要探讨狄斯瓦螨对意蜂工蜂呼吸代谢的影响,为今后深入研究狄斯瓦螨与意蜂之间的相互作用奠定基础。【方法】应用SSI多通道昆虫呼吸仪测定感染狄斯瓦螨意蜂与健康意蜂不同发育阶段(4日龄幼虫、5日龄蛹、新出房成蜂和6日龄成蜂)工蜂的耗氧量、CO₂释放量和呼吸商,并分析其变化特征;同时采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析狄斯瓦螨感染意蜂与健康意蜂成年工蜂中呼吸代谢相关基因(Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt)的表达量变化。【结果】受狄斯瓦螨侵染后,意蜂工蜂耗氧量、CO₂释放量呈现出先上升后下降的趋势,其中耗氧量从5日龄蛹期的0.0244 mL/min下降至6日龄成蜂期的0.0093 mL/min; CO₂释放量从5日龄蛹期的0.0174 mL/min下降...     

不同行为表现的蜜蜂脑部多巴胺及其受体基因的检测分析

【目的】对不同行为表现的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂脑部多巴胺及其受体基因进行检测。【方法】从蜜蜂观察箱中采集不同行为表现的工蜂,解剖其脑部,用高效液相色谱-电化学检测器和实时荧光PCR仪分别检测多巴胺含量和受体基因相对表达量,并进行计算分析研究。【结果】建立了不同行为表现的蜜蜂脑部多巴胺及受体基因的研究方法。意大利蜜蜂哺育蜂脑部的多巴胺含量与新出房工蜂、采集蜂、休息状态下的工蜂存在显著差异。多巴胺受体1基因及多巴胺转运体基因在哺育蜂脑部处于高表达状态,4种不同分工的意大利蜜蜂脑部多巴胺受体2基因、受体3基因相对表达量差异不显著。【结论】多巴胺与蜜蜂不同行为表现密切相关,多巴胺受体1基因与转运体基因可能参与蜜蜂哺育行为。     

三种化学感受蛋白在意大利蜜蜂成年工蜂中的时空表达水平研究

【目的】化学感受蛋白(Chemonsensory proteins,CSPs)是一类可溶性小分子蛋白质,广泛存在于昆虫的触角及其他感受器中,参与昆虫的化学感受行为,在昆虫化学感受系统中发挥重要的作用,本文旨在探究Amel-CSP1、Amel-CSP2和Amel-CSP6在意大利蜜蜂成年工蜂中的时空表达水平及生理功能。【方法】首先通过荧光定量PCR技术检测了Amel-CSP1、Amel-CSP2和Amel-CSP6在哺育蜂和采集蜂的触角、头部、胸部、腹部和腿的表达水平;然后又对不同日龄工蜂(1,6,12,18,28日龄)触角中Amel-CSP1、Amel-CSP2和Amel-CSP6的表达情况进行检测。【结果】(1)Amel-CSP1在工蜂的触角和头部都有较高的表达水平,其在工蜂触角中的表达水平显著高于其他部位(P0.05);Amel-CSP2在哺育蜂触角中表达水平最高,显著高于其他部位(P0.05),而其在采集蜂头部的表达水平最高,显著高于其他部位(P0.05);Amel-CSP6在哺育蜂和采集蜂的头部表达量最高,其在触角、胸部也有较高表达水平。(2)Amel-CSP1在工蜂触角中的表达水平随日龄的增长而增加,其在28日龄的表达水平显著高于其他日龄(P0.05);Amel-CSP2在1日龄和12日龄工蜂触角的表达量最高,显著高于其他日龄(P0.05);Amel-CSP6在28日龄工蜂触角中的表达水平最低,显著低于其他日龄(P0.05)。【结论】Amel-CSP1、Amel-CSP2、Amel-CSP6在意大利蜜蜂成年工蜂中的表达具有明显的时空特异性,这对进一步探测意大利蜜蜂CSPs家族的生理功能提供了研究方向和理论基础,具有一定的生物学意义。     

西方蜜蜂采集蜂上颚腺中高表达基因的筛选与表达分析

【目的】本研究旨在筛选西方蜜蜂Apis mellifera采集蜂上颚腺中高表达基因,为进一步筛选和研究蜜蜂采集行为相关基因提供依据。【方法】基于前期测序的西方蜜蜂5种不同职能工蜂(3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、10日龄采集蜂、21日龄哺育蜂和21日龄采集蜂)上颚腺转录组数据,筛选采集蜂上颚腺的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并对这些DEGs进行GO和KEGG分析;qRT-PCR检测随机选取的8个DEGs在10日龄哺育蜂和10日龄采集蜂上颚腺以及两个关键DEGs(Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因Amp5cs和细胞色素P450 9e2基因CYP9Q3)在工蜂不同发育时期和采集蜂各组织中的表达量。【结果】筛选到22个DEGs在21日龄采集蜂上颚腺中的表达量显著高于在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂上颚腺中的表达量,同时在10日龄采集蜂上颚腺中的表达量也显著高于在10日龄哺育蜂上颚腺中的表达量。GO和KEGG富集分析显示这些DEGs主要富集在胆固醇代谢、半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、细胞凋亡-果蝇、氨基酸生物合成等方面。qRT-PCR结果表明,8个DEGs(LOC100576395, LOC411983, LOC410235, LOC725581, LOC410527, LOC406131, LOC408453和LOC410253)的表达模式与转录组数据的表达模式一致;2个关键DEGs Amp5cs和CYP9Q3在工蜂各发育阶段均有表达,且在采集蜂中表达量最高;Amp5cs在采集蜂腹、胸、上颚腺和触角中高量表达,P450 9e2在采集蜂触角 和足中表达量显著高于在其他组织中的。【结论】本研究在减小日龄因素干扰下筛选了西方蜜蜂采集蜂上颚腺中22个高表达的DEGs,这些DEGs可能主要参与采集蜂上颚腺生理发育以及能量供应、外源性物质解毒、花蜜转化等代谢通路,进而影响蜜蜂的采集行为。这些结果为西方蜜蜂上颚腺的功能研究提供理论参考,同时也为采集力强的新品种培育奠定了基础。     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响

摘要: 【目的】吡虫啉(imidaclorprid)是广泛使用的新烟碱类杀虫剂之一。大量研究表明亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)幼虫的发育和成年蜜蜂的采集、学习等行为。本实验旨在探究亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂内勤蜂(1日龄成年工蜂)与外勤蜂(21日龄成年工蜂)免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响,进而为蜜蜂健康的维护提供科学依据。【方法】测定饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液不同时间后意蜂成年工蜂的存活率;利用荧光定量PCR检测饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液6 d后其体内免疫基因多酚氧化酶基因(PPOA3, GenBank登录号： GB43738), Abaecin类抗菌肽基因(ABA, GenBank登录号： GB18323),葡萄糖脱氢酶基因(GLD, GenBank登录号： GB43007)和解毒基因细胞色素P450基因(CYP450 6a2, GenBank登录号： GB49876)的表达,并采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定其体内细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)含量和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活力。【结果】1日龄和21日龄意蜂成年工蜂连续饲喂6 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,其存活率与对照组(饲喂含0.1 ng/μL丙酮的50%蔗糖溶液)无显著差异;连续饲喂9 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,1日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组无显著差异,而21日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组有显著差异。1日龄意蜂成年工蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液6 d后, PPOA3, CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平,细胞色素P450含量以及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势;而21日龄意蜂成年工蜂取食该药液6 d后,CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势,PPOA3表达水平和细胞色素P450含量有显著上调趋势。【结论】亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因的表达及免疫解毒酶系活力;吡虫啉短期胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活无显著影响,长期胁迫则会影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活。     

RNAi沉默王浆主蛋白1(Mrjp1)基因对意大利蜜蜂工蜂学习和记忆的影响

【目的】前期研究发现经吡虫啉处理的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)工蜂学习能力下降,转录组学分析表明王浆主蛋白1(major royal jelly protein 1, MRJP1)基因在吡虫啉处理的蜜蜂脑中显著下调,MRJP1可能参与调控蜜蜂学习能力。本研究旨在采用RNA干扰(RNAinference, RNAi)技术将Mrjp1特异性沉默,验证MRJP1在意蜂工蜂嗅觉学习中的关键作用。【方法】通过克隆技术获得Mrjp1基因cDNA 序列,经测序验证后,设计引物,合成用于RNAi干扰Mrjp1基因表达的dsRNA。注射dsMrjp1的意蜂工蜂作为处理组(dsMrjp1注射组),注射dsEGFP的意蜂工蜂作为对照组(dsEGFP注射组),随后通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)实验比较两组的嗅觉学习与记忆能力差异。最后采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测注射dsMrjp1后意大利蜜蜂工蜂脑中Mrjp1的相对表达量。【结果】dsMrjp1注射组与dsEGFP注射组意蜂工蜂学习能力差异显著,dsMrjp1注射组意蜂工蜂的学习能力显著降低。学习后2 h,两组意蜂工蜂的记忆力无显著差异。qRT-PCR结果显示Mrjp1的表达水平在dsMrjp1注射组意蜂工蜂脑中显著低于dsEGFP注射组,表明学习能力降低的处理组意蜂脑内对应的Mrjp1表达水平也降低。【结论】通过RNAi抑制意蜂工蜂Mrjp1基因的表达后,其嗅觉学习能力受到显著性抑制,但记忆力未受到显著影响,提示Mrjp1可能是调控意蜂学习的重要基因之一。本研究结果有助于后续进一步研究蜜蜂嗅觉学习相关的分子机制。     

三种微小RNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程中的表达谱及潜在功能

[目的]意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica是生产性能优良的西方蜜蜂Apis mellifera亚种.本研究旨在利用分子生物学手段揭示3种微小RNA(microRNA,miRNA) ame-miR-13b,ame-miR-100和ame-miR-bantam调控蛹期变态发育的分子机理.[方法]通过...     

The microRNA ame-miR-279a regulates sucrose responsiveness of forager honey bees (Apis mellifera)

Increasing evidence demonstrates that microRNAs (miRNA) play an important role in the regulation of animal behaviours. Honey bees (Apis mellifera) are eusocial insects, with honey bee workers displaying age-dependent behavioural maturation. Many different miRNAs have been implicated in the change of behaviours in honey bees and ame-miR-279a was previously shown to be more highly expressed in nurse bee heads than in those of foragers. However, it was not clear whether this difference in expression was associated with age or task performance. Here we show that ame-miR-279a shows significantly higher expression in the brains of nurse bees relative to forager bees regardless of their ages, and that ame-miR-279a is primarily localized in the Kenyon cells of the mushroom body in both foragers and nurses. Overexpression of ame-miR-279a attenuates the sucrose responsiveness of foragers, while its absence enhances their sucrose responsiveness. Lastly, we determined that ame-miR-279a directly target the mRNA of Mblk-1. These findings suggest that ame-miR-279a plays important roles in regulating honey bee division of labour.     

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达微小RNA及其靶基因分析

【目的】蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称球囊菌)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫肠道的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一种在转录后水平对m RNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达mi RNAs(DEmiRNAs)及其靶基因进行深入分析,为揭示DEmiRNAs在胁迫应答中的作用提供重要信息。【方法】利用small RNA-seq(s RNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂6日龄幼虫肠道(分别表示为Am CK和Am T)进行测序,通过相关生物信息学软件对DEmiRNAs进行预测和分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNAs的靶基因,然后利用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库的功能注释。通过Cytoscape软件构建DEmiRNAs与其靶m RNAs的调控网络。通过茎环实时荧光定量PCR(stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Am CK和Am T的测序分别得到9 230 496和10 823 667条有效序列标签; Am CK vs Am T比较组中包含15个上调和6个下调mi RNAs,分别结合3 503和3 252个靶基因,它们可分别注释到40和39个GO terms以及104和99条代谢通路;进一步分析发现调控网络中的17个DEmiRNAs靶向结合116个与丝氨酸蛋白酶相关的m RNAs,14个DEmiRNAs靶向结合54个与泛素介导的蛋白水解相关的m RNAs。Stem-loop RT-qPCR验证结果显示随机选择的4个DEmiRNAs (mi R-251-x,mi R-9277-y,mi R-1672-x和mi R-4968-y)的表达量变化趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可信。【结论】本研究率先对意蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的DEmiRNAs及其靶基因进行预测与分析,提供了mi RNAs的表达谱和差异表达信息。ame-miR-927b,mi R-429-y和mi R-8440-y等DEmiRNAs可能参与对丝氨酸蛋白酶的调控和对泛素介导的蛋白水解的调控,DEmiRNAs与靶基因之间存在复杂的调控网络关系。DEmiRNAs可参与到意蜂幼虫肠道与球囊菌间的互作。     

参与调控意大利蜜蜂工蜂中肠基因表达的东方蜜蜂微孢子虫miRNA的组学解析及其调控网络

[目的]本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae 的差异表达 miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)靶向意大利蜜蜂 Apis mellifera ligustica 工蜂中肠的 mRNA 和差异表达 mRNA(d...     

西方蜜蜂不同级型王浆主蛋白MRJP8基因的表达差异

王浆主蛋白在蜜蜂的级型分化中具有重要的功能。为探究mrjp8在西方蜜蜂Apis mellifera不同级型的表达模式及功能差异。【方法】 利用荧光定量PCR技术对西方蜜蜂工蜂、 雄蜂和蜂王不同发育时期和不同组织的mrjp8表达水平进行检测。【结果】 工蜂体内mrjp8在9日龄前后的毒腺组织内特异性高表达, 为参照基因表达量的上万倍, 在其他发育时期和组织的表达量则明显较低, 其表达具有明显的时空特异性; 在雄蜂体内其表达量与对照相当; 在蜂王体内表达量可达参照的近1 000倍, 没有组织特异性。【结论】 mrjp8的这种表达模式提示其在工蜂防御及维系蜂王长寿命方面有积极作用, 这为进一步研究该基因乃至整个王浆蛋白基因家族的进化和功能分化提供了依据。